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《中国医科大学》 2002年
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蕈样肉芽肿与HSV-1、HSV-2、EBV、HCMV及HHV-8相关性的研究

徐宏慧  
【摘要】: 目的 通过检测蕈样肉芽肿(granuloma fungoides,曾称蕈样霉菌病,mycosis fungoides,MF)皮损及外周血中人类疱疹病毒1型(又称单纯疱疹病毒-1,herpes simplex virus 1,HSV-1)、2型(单纯疱疹病毒-2,HSV-2)、4型(EB病毒,EBV)、5型(人类巨细胞病毒,human cytomegalovirus,HCMV)及8型(human herpesvirus 8,HHV-8)的特异性DNA序列,探讨MF与这五型人类疱疹病毒之间的相关性。 材料与方法 一、实验材料 (一)研究材料 1、病例资料 32份皮损及15份外周血标本取自33例经临床和病理确诊的蕈样肉芽肿患者,均来自中国医科大学第一医院皮肤科。 2、对照资料 (1)其它皮肤病患者:慢性湿疹患者皮损13份、外周血6份,慢性单纯苔藓患者皮损11份、外周血5份; (2)正常对照:正常皮肤29份及健康献血员外周血40份; p)阳性对照:HSV-1感染的细胞中提取的 DNA作为 HSV -1的阳性对照;EBV和HHV-8共感染的细胞系(BC-1)中提 取的DNA作为EB病毒及HHV-8 DNA的阳性对照。 (二)引物 1.内对照引物:扩增人类p-球蛋白基因的特异性引物 PC03/PC04,PC03序列:5’一 ACA CAA CTG TGT TCA CTA GC- 3’,PCM序列:5’-CAA Cn CAT CCA C盯 TCA CC-3二产物长 度 110hp。 人扩增HSV-1、HSV-2JBV和HCMV的通用引物,上游引 物(P-l)序列:5’-CGA CTT TGC CAG CCT GTA CC-3二下游引 物(P-2)序列:5’-AGT CCG TGT CCC CGT AGA TG-3’。HSV 叫、HSV-2上BVJCMV经该引物扩增后,产物片段长度分别为 518hp、518hp、524hp和589hp。 3、扩增 HHV-8 KS330Bam片段的特异性引物,KSI序歹:5’ -AGC CGA AAG GAT TCC ACC AT-3二人 序列:5’-TCC GTG ’ITG TCT ACG TCC AG-3’,产物长度233hP。 二、实验方法 l、DNA的提取 采用酚-氯仿法提取皮损及外周血白细胞中基因组 DNA,以 紫外分光光度计测定浓度及纯度后,-20℃保存待用。 2、PCR技术 所提取的DNA均以引物PC03/PC04扩增人p-球蛋白,产物 片段长度 110hP,阳性标本人选本实验。以 HSV-l、HSV-2、 EBV、HCMV的通用引物P-l/P-2,采用聚合酶链反应(o灯me。 ase chain reaction,PCR)技术检测上述病毒DNA序列。PCR反应 后,通过对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,可直接将HCMy分辨 开来。以针对HHV-8 DNA KS330Bam片段的特异性引物KSI/ KSZ检测 HHV-8,产物长度为 233 hP。 ·2· 3、限制性核酸内切酶酶切鉴定 琼脂糖凝胶电泳后,以DNA片段回收试剂盒回收通用引物P -l/P-2扩增的阳性产物O 左右入以限制性内切酶BalnH I和Sma作酶切分析,区分HSV-l、HSV-2及 EBV。以特异 性限制性核酸内切酶PSt互对KSI/KSZ.扩增产物K)作酶切 反应,酶切产物以12%聚丙烯酚胺凝胶电泳鉴定。 结 果 一、HSV—1、HSV—2、EBV、HCMV检测结果: (一严CR结果 1.阳性对照:以通用引物P-l/P一二扩增HSV—1感染细胞 中提取的DNA和BC-1细胞DNA后,均出现长度约520hP 的片 段; 2、荤样肉芽肿患者:32份皮损中有7份J5份外周血中有2 份均扩增出长度约520hp的产物; 3、其它皮肤病:24份皮损* 份外周血以通用引物扩增后均 末见阳性条带; 4、正常对照:29份正常皮肤/0份健康献血员外周血中均阴 性。 (二)PCR产物的 BamH和 Sma ]:酶切分析结果: 2份章样肉芽肿皮损及2份外周血中检出的520hP左右的产 物回收后,均被 Sma切成476hp和412hp,但不能被 BamH切 断,与预期结果及mV八阳性对照一致,证实为田V-IDNA来 源;另外5份章样肉芽肿皮损中检出的520hP左右的产物回收后, MIJ被 BamH和 Sma切成 247hP *77hP和 100hP、424hP两段, 与预期结果及EBV阳性对照一致,证实为EBV DNA来源。HSV -1在阜样肉芽肿皮损与外周血中无同时阳性者,并且所有标本 ·3· 无HSV-l与EB病毒同时阳性者。PCR扩增及酶切结果显示, 所有蜜样肉芽肿皮损及外周血中均未检出HSV-2及HCMV DNA。正常对照及慢性湿疹、慢性单纯苔薛标本中均未检出此四 型人类疤疹病毒DNA。 经X‘检验荤样肉芽肿皮损及外周血中HSV刁检出率与正 常皮肤(P=0.493入献血员外周血(P二 0.194)以及慢性湿疹。 慢性单纯苔鲜患者的皮损(P=0.50X外周血(P二 0.492)比 较,差异均无显著性。章样肉芽肿皮损及外周血中EBV检出率与 正常皮肤(P=0.054人慢性湿疹及慢性单纯苔蔡患者的皮损汐 =0.064)比较/值均大于0.05,差异也无显著性。 二、HHV-8检测结果 (一严CR结果 且、阳性对照:BC-二DNA经引物对Ka/K驭可扩增出233… 产物,此产物被限制性内切酶pstl酶切成138hp和95hp两段; 2、章样肉芽肿患者:32份皮损中有8份及15份外周
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:R739.5

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