钙离子和维生素D_3对宫颈癌细胞增殖的影响

【摘要】： 前言 钙离子(Ca~(2+))是细胞内最普遍而重要的信号转导成分，细胞内钙离子浓度([Ca~(2+)]_i)的变化在调控细胞的基因转录，DNA合成、DNA修复以及有丝分裂等一系列生理病理过程中起着重要作用，与细胞增殖、基因突变以及肿瘤细胞的发生发展密切相关。研究表明，低Ca~(2+)易诱发恶性肿瘤，维生素D_3(VD_3)一方面作为促进钙吸收的活性物质，通过与钙的协同效应发挥抗肿瘤作用；另一方面，VD_3通过与维生素D受体(VDR)的结合，改变基因转录的速度，从而调节细胞的增生、分化和凋亡。本实验研究拟通过四甲基唑盐比色法(MTT)及同位素放射自显影法(ARG)检测Ca~(2+)及VD_3对人宫颈癌细胞增殖的影响，探讨Ca~(2+)和VD_3在宫颈癌细胞增殖过程中的调控作用。 材料与方法 1．实验材料 人宫颈癌细胞株Hela细胞为中国医科大学细胞生物实验室惠赠；人宫颈癌组织取材于中国医科大学附属第一医院妇产科；~3H-TdR，原子核乳胶购于中国原子能研究所；HPMI1640培养基购于life technology USA；96孔培养板、MTT、胰酶购于华美生物工程公司；新生小牛血清购于天津生化制品厂。其它试剂均达分析纯。 2．实验方法 2．1 细胞实验部分 Hela细胞株在含10％小牛血清的RPMll640培养液中（内含 0．1％青霉素、链霉素）培养并置于 5％CO卜95％空气＊7℃孵箱 内，待细胞长满后，用 0．25％胰酶消化，传代培养。将 Hela细胞制 成 lx 10’cells／Inl细胞悬液，置 96孔培养板内，100冲孔，，37℃， 5％CO。条件下培养24 ／J’时，进行下述实验。实验分为：不同 Ca卜 浓度处理组；VD。处理组；Cak与VD。协同处理组；维拉帕米（VP） 与 Ca人共同作用组JP与 VD。及 Caz”共同作用组等实验组，同时 设立空白对照组。对照组只加人RPMll640培养液，最后使各孔 的终体积相等。37t下继续培养，分别在培养的6在4／8＊2小时 后加人 ig／L的 MrIT；20wIL，继续培育4小时，弃去培养液，加入 二甲基亚现，＊0卜V孔，微振荡15分钟，置酶标仪上，在波长为 490urn时测吸光度则D）值。 2．2 临床标本实验部分 在无菌条件下取新鲜的宫颈癌组织快速放人4℃含RP－ Mll640培养液的平M中，在 5分钟内将材料分切成 lx 3nun的小 块。将标本放人含10％小牛血清RPMll640培养液的培养皿中继 续培养。实验分组为：肿瘤细胞对照组；高 Ca厂作用组；VD。作用 组；高 Ca卜十VD3组；Ca卜通道阻滞组 1：VP＋Ca卜；Ca卜通道阻滞 组人VP＋Caz”＋VD如对照组为单纯 nyMll640培养液，最后使 各平皿中溶液的终体积相等。将培养皿置于 5％CO卜95％空气。 37℃孵箱内，培养72小时。将各培养皿中的液体及标本收集于小 瓶中，并做好标记，向各小瓶中加人’H－TdR人 pCirlnl，将小瓶放 人37t恒温箱内的磁力搅拌器上，缓慢搅拌90分钟，取出小瓶后 去掉上清液，在常温下用10nd不含小牛血清的培养液冲洗三次。 经梯度酒精脱水、浸腊、包埋、切片制成 7 pm的石蜡切片，暗室内 涂乳胶，放人4℃冰箱内曝光ZI天，经显影、定影＼染色＼封片后于 显微镜下观察细胞标记情况。在各组切片中，随机取5个视野，计 数每100个细胞中标记细胞的个数。 ·二· 结 果 1．M’IT比色法检测不同药物对Hela细胞增殖的影响 各组药物作用于Hela细胞6 ／J’时后对其增殖的影响与对照 组相比无统计学意义；而作用24 ／J’时后，10mM，20mM的h‘均使 细胞的生长速度减慢，抑制率分别为10％，15％；随着作用时间的 延长，进一步抑制其生长速度；72h后，10mM在0mM的Cak对He－ la细胞的抑制率分别达15％30％。而ZInM的Cah在各个时间 点对Hela细胞的生长速度均无显著影响。加 VD。于各浓度的 Ca卜中，作用于 Hela细胞，24小时后，Hela细胞的生长速度减慢， 抑制率分别为5％在0％J4％，且随着作用时间的延长，抑制率增 加，72 ／J’时后各组的抑制率分另为12％J2％j4％。Ca卜对Hela 细胞增殖的抑制作用具有浓度、时间依赖性，VD。对其有协同效 应。VP可桔抗hh对Hela细胞增殖的抑制作用，而对VD。的作 用不明显，提示外钙内流是高钙引起的抑制细胞增殖作用的一个 主要途径，而VD3起的抑制细胞增殖的作用则与外钙内流不甚 相关，提示可能有其它机制的参与。 2．同位素放射自显影检测不同药物对宫颈癌组织细胞标记率 的影响 如照片所示，与对照组（Pie．l）相比，20mM Ca八（Pie．2）可使 细胞的标计率下降，但100nM VD／Pie．3你对细胞的标记率无显 著的影响，但可促进 20mM Cah的作用，与 CaZ”协同进一步使细 胞的标记率下降瞩．4人 如图H．5所示JP可桔抗 Cak降低细胞标记率的作用，使 之与对照组相比较无显著差别，说明高钙引起的外钙内流作用被 VP阻断后其抑制细胞增殖的作用随之被取消，若 VP与 Ca人及 VD。同时作用，则VP不能完全阻龈者引起的抑制细胞增殖的作 ·3· 用，说明 VD。协同

【关键词】：钙离子 维生素D_3 Hela细胞 宫颈癌 细胞增殖
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2002
【分类号】：R737.33
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