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《中国医科大学》 2002年
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钙离子和维生素D_3对宫颈癌细胞增殖的影响

于君丽  
【摘要】: 前言 钙离子(Ca~(2+))是细胞内最普遍而重要的信号转导成分,细胞内钙离子浓度([Ca~(2+)]_i)的变化在调控细胞的基因转录,DNA合成、DNA修复以及有丝分裂等一系列生理病理过程中起着重要作用,与细胞增殖、基因突变以及肿瘤细胞的发生发展密切相关。研究表明,低Ca~(2+)易诱发恶性肿瘤,维生素D_3(VD_3)一方面作为促进钙吸收的活性物质,通过与钙的协同效应发挥抗肿瘤作用;另一方面,VD_3通过与维生素D受体(VDR)的结合,改变基因转录的速度,从而调节细胞的增生、分化和凋亡。本实验研究拟通过四甲基唑盐比色法(MTT)及同位素放射自显影法(ARG)检测Ca~(2+)及VD_3对人宫颈癌细胞增殖的影响,探讨Ca~(2+)和VD_3在宫颈癌细胞增殖过程中的调控作用。 材料与方法 1.实验材料 人宫颈癌细胞株Hela细胞为中国医科大学细胞生物实验室惠赠;人宫颈癌组织取材于中国医科大学附属第一医院妇产科;~3H-TdR,原子核乳胶购于中国原子能研究所;HPMI1640培养基购于life technology USA;96孔培养板、MTT、胰酶购于华美生物工程公司;新生小牛血清购于天津生化制品厂。其它试剂均达分析纯。 2.实验方法 2.1 细胞实验部分 Hela细胞株在含10%小牛血清的RPMll640培养液中(内含 0.1%青霉素、链霉素)培养并置于 5%CO卜95%空气*7℃孵箱 内,待细胞长满后,用 0.25%胰酶消化,传代培养。将 Hela细胞制 成 lx 10’cells/Inl细胞悬液,置 96孔培养板内,100冲孔,,37℃, 5%CO。条件下培养24 /J’时,进行下述实验。实验分为:不同 Ca卜 浓度处理组;VD。处理组;Cak与VD。协同处理组;维拉帕米(VP) 与 Ca人共同作用组JP与 VD。及 Caz”共同作用组等实验组,同时 设立空白对照组。对照组只加人RPMll640培养液,最后使各孔 的终体积相等。37t下继续培养,分别在培养的6在4/8*2小时 后加人 ig/L的 MrIT;20wIL,继续培育4小时,弃去培养液,加入 二甲基亚现,*0卜V孔,微振荡15分钟,置酶标仪上,在波长为 490urn时测吸光度则D)值。 2.2 临床标本实验部分 在无菌条件下取新鲜的宫颈癌组织快速放人4℃含RP- Mll640培养液的平M中,在 5分钟内将材料分切成 lx 3nun的小 块。将标本放人含10%小牛血清RPMll640培养液的培养皿中继 续培养。实验分组为:肿瘤细胞对照组;高 Ca厂作用组;VD。作用 组;高 Ca卜十VD3组;Ca卜通道阻滞组 1:VP+Ca卜;Ca卜通道阻滞 组人VP+Caz”+VD如对照组为单纯 nyMll640培养液,最后使 各平皿中溶液的终体积相等。将培养皿置于 5%CO卜95%空气。 37℃孵箱内,培养72小时。将各培养皿中的液体及标本收集于小 瓶中,并做好标记,向各小瓶中加人’H-TdR人 pCirlnl,将小瓶放 人37t恒温箱内的磁力搅拌器上,缓慢搅拌90分钟,取出小瓶后 去掉上清液,在常温下用10nd不含小牛血清的培养液冲洗三次。 经梯度酒精脱水、浸腊、包埋、切片制成 7 pm的石蜡切片,暗室内 涂乳胶,放人4℃冰箱内曝光ZI天,经显影、定影\染色\封片后于 显微镜下观察细胞标记情况。在各组切片中,随机取5个视野,计 数每100个细胞中标记细胞的个数。 ·二· 结 果 1.M’IT比色法检测不同药物对Hela细胞增殖的影响 各组药物作用于Hela细胞6 /J’时后对其增殖的影响与对照 组相比无统计学意义;而作用24 /J’时后,10mM,20mM的h‘均使 细胞的生长速度减慢,抑制率分别为10%,15%;随着作用时间的 延长,进一步抑制其生长速度;72h后,10mM在0mM的Cak对He- la细胞的抑制率分别达15%30%。而ZInM的Cah在各个时间 点对Hela细胞的生长速度均无显著影响。加 VD。于各浓度的 Ca卜中,作用于 Hela细胞,24小时后,Hela细胞的生长速度减慢, 抑制率分别为5%在0%J4%,且随着作用时间的延长,抑制率增 加,72 /J’时后各组的抑制率分另为12%J2%j4%。Ca卜对Hela 细胞增殖的抑制作用具有浓度、时间依赖性,VD。对其有协同效 应。VP可桔抗hh对Hela细胞增殖的抑制作用,而对VD。的作 用不明显,提示外钙内流是高钙引起的抑制细胞增殖作用的一个 主要途径,而VD3起的抑制细胞增殖的作用则与外钙内流不甚 相关,提示可能有其它机制的参与。 2.同位素放射自显影检测不同药物对宫颈癌组织细胞标记率 的影响 如照片所示,与对照组(Pie.l)相比,20mM Ca八(Pie.2)可使 细胞的标计率下降,但100nM VD/Pie.3你对细胞的标记率无显 著的影响,但可促进 20mM Cah的作用,与 CaZ”协同进一步使细 胞的标记率下降瞩.4人 如图H.5所示JP可桔抗 Cak降低细胞标记率的作用,使 之与对照组相比较无显著差别,说明高钙引起的外钙内流作用被 VP阻断后其抑制细胞增殖的作用随之被取消,若 VP与 Ca人及 VD。同时作用,则VP不能完全阻龈者引起的抑制细胞增殖的作 ·3· 用,说明 VD。协同
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:R737.33

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