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《中国医科大学》 2002年
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HGF对兔关节软骨细胞培养影响的实验研究

赵忠海  
【摘要】: 前言 关节软骨组织损伤、破坏多,但其自身修复能力差。组织工程技术的兴起、发展为体外培养软骨组织提供了可能,为软骨组织的修复提供了新途径。但体外培养的软骨细胞生长缓慢,老化快,不能适应临床的需要。近年来人们发现一种叫细胞因子的物质在细胞生长、增殖、发育、代谢过程中发挥作用。通过在体外培养的软骨细胞中填加细胞因子,会加速细胞增殖,延缓衰老。 10多年前人们发现了HGF,并多用于促进肝细胞的组织修复和再生。HGF作为一种多功能因子,对多种组织、器官发挥作用。人们发现软骨细胞表达HGF受体,并对其发生反应。HGF在体内外均可调节软骨细胞的增殖和分化。外源性HGF能加强骨、软骨的形态发生,提高培养软骨细胞Ⅱ型胶原mRNA的表达和碱性磷酸酶活性。HGF能明显增强损伤软骨等组织器官的修复能力。 我们在体外培养得到软骨细胞,通过免疫组化技术和Giemsa染色技术在显微镜下确定其符合软骨细胞的形态特征,并证明其具有软骨细胞所特有的分泌Ⅱ型胶原的能力。在传代细胞中加入HGF,通过、MTT技术、流式细胞仪技术验证HGF对关节软骨细胞的促增殖作用,摸索其最佳作用浓度。 实验材料 1.主要仪器:二氧化碳孵箱、超净工作台、酶联免疫检测仪、流式细胞仪、多孔培养板、倒置显微镜等。 2.主要试剂:DMEM培养基,HGF,IGF-1,rhIGF-1,PI,MTT,RNase,胎牛血清,Ⅱ型胶原抗体,胰蛋白酶。 3.实验动物:二周龄新西兰白兔,购于医大二院动物室。 实 验方 法 1.无菌条件下切取2周龄兔关节软骨,制成细胞悬液,用含 FBS的DMEM培养。 2.倒置显微镜观察细胞接种后、细胞贴壁后以及细胞传代的 形态。 3.细胞爬片Giemsa染色光镜观察细胞生长情况。 4.细胞爬片、甩片免疫组化法检测11型胶原表达情况。 5.细胞加生长因子培养,*u检测了解细胞生长因子对细胞 存活数的影响。 6.流式细胞仪检测细胞生长因子对软骨细胞增殖的影响。 实 验 结 果 *倒置显微镜下观察接种后细胞具有软骨细胞的特征,可以 传代。软骨细胞第1-4代的形态变化基本上一致从后随着细胞 传代次数的增多,逐渐可以见到肥大细胞增多,这种细胞很大,胞 浆很多,核很小并且固缩,反光增强,见不到核分裂相。这说明软 骨细胞在传代多次后增殖能力减低,成熟细胞增多,甚至接近于细 胞凋亡状态。 2.Giemsa染色光镜观察见软骨细胞形态更加清楚,呈多角 形,小菱形。 3.免疫组化结果说明培养的细胞具有软骨细胞的特征。 4.Mtt测定结果说明不同浓度的HGF均可以促进关节软骨细 胞的增殖,而以HGF的浓度为10ngirnl时作用效果最明显。但较 之mF,HGF的作用为弱,IGF的促增殖作用更明显,IGF的最佳作 ·2· 用浓度为50n矿ml。 5.流式细胞仪测定结果测得的细胞周期图形使用机器自备的 软件处理、分析发现,HGF和IC。F均可刺激细胞增殖。这与Mtt测 定结果一致。而且HGF和IGF联合作用的增殖效果更加明显,分 别优于 HGF和mF的单独作用。 讨 论 1.软骨细胞有丝分裂活动极低,其自身修复能力差。体外培 养的软骨细胞增殖很有限。临床上由于外伤或疾病造成的关节软 骨缺损自身很难修复。我们通过给体外培养的软骨细胞中填加 HGF,使软骨细胞增殖速度加快,数据有统计学意义。细胞生长因 子促进细胞增殖作用的情况,一种是促进细胞数目增加,另一种是 使休眠细胞进入增殖状态。软骨细胞表达HGF受体,HGF {f助 于一种具有酪氨酸酶活性的跨膜受体的激活来发挥其生物学效 应。该受体是C-md原癌基因的表达产物,称为Met。成熟的 Met受体位于细胞膜上,是由一条。链和一条p链通过二硫键连 接而成的异二聚体。p链有胞外区、跨膜区和胞内区,a链只有胞 外区部分,借助于二硫键附于ei链上。p和a链的胞外区是配体 识别部位,可识别并结合HGF;而胞内部位具有酪氨酸激酶活性, HGF激活的Met受体发生自动磷酸化,其酪氨酸激酶活性增强, 导致多种底物蛋白的酪氨酸磷酸化,继而发挥其调节细胞增殖、分 化和运动的功能。HGF通过刺激细胞迁移J殖和合成蛋白多糖 等多种作用,促进软骨再生。在软骨形成过程中,HGF能特异地 作用于软骨细胞,对其具有趋化性和致有丝分裂活性,并促其合成 基质。尽管HGF的作用比类胰岛素细胞生长因子门)弱,但在 相同条件下,HGF能同时刺激软骨细胞迁移和合成蛋白多糖。 HGF是目前已知的唯一的多功能因子。 ·3· 上HGF的作用存在剂量效应关系。不同浓度的HGF对关节 软骨细胞增殖的促进作用不同。利用Mtt法对细胞增殖进行检 测,Mtt是一种能接受氢原子的染料,活细胞线粒体的滤用脱氢酸 能使外源性的Mtt还原为难溶性的蓝紫色结晶物,并沉积在细胞 中,而死细胞无此功能。在一定细胞范围内,Mtt结晶形成的量与 细胞数
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:R684

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