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《中国医科大学》 2002年
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结合珠蛋白在正常人皮肤内的表达及相关性研究

王合  
【摘要】: 前言 表皮由角质形成细胞(keratinocytes,KC)、朗格汉斯细胞(Langerhans cells,LC)、黑色素细胞、未定型细胞、Merkel细胞、淋巴细胞等组成,其中KC占表皮细胞总数的95%左右,LC约占表皮细胞总数的2%-5%。 KC不仅在皮肤屏障功能中起着重要作用,同时也是皮肤免疫系统的重要组成部分。研究证明KC除了能产生许多细胞角蛋白及粘多糖等保持皮肤生化及物理的完整性外,还产生多种细胞因子,如:IL-1、IL-6、IL-7、IL-8、TNF-α、GM-CSF、IL-3、TGF等,调节淋巴细胞和LC活性。 人角质形成细胞HaCaT细胞系是由Norbert E.Fusenig从正常人皮肤分离出的第一个永久性人角质形成细胞系。目前,HaCaT细胞系细胞被认为是在体外培养中自发转变的、可永久传代的非肿瘤性细胞。 LC能捕获外来抗原,并将其递呈给引流淋巴结内的T细胞。LC因其抗原递呈功能而被认为对维持皮肤免疫的自身平衡有重要的作用,但其功能易受内外环境因子影响。新分离的(或位于表皮内的)LC可以激活异体T细胞,但不能激活自身未致敏的(naive)淋巴细胞。当在培养液中加入GM-CSF后,培养的LC表面的MHC Ⅰ、Ⅱ类抗原明显增加,并可表达多种对未致敏T细胞有协同刺激作用的因子,如B7、ICAM-1、CD40及IL-1β。同时,LC的功能也发生变化,可以在体外激活自身T细胞,即功能上由不成熟向成熟转变。但局部或周身给予外源性GM-CSF却不能诱导表皮LC在表皮内发生功能转变。同时发现,患有可以分泌GM-CSF的肿瘤的小鼠血中GM-CSF水平虽然很高,但其表皮内的LC却没有“培养后的”表型,也没有抗原递呈功能。谢勇等认为在血清中存在一种可以抑制LC受GM-CSF作用而发生功能转变的因子。经分析,确定这种分子就是结合珠蛋白(haptoglobin,Hp)(α_1链)。 Hp是一种α_2-唾液酸糖蛋白(α_2-sialoglycoprotein),分布于人及其他哺乳动物的大部分体液内。Hp主要在肝脏合成,在脂肪组织、肺及其他 多种组织中也可以合成。Hp是一种活跃的急性期蛋白(acute phase pro- tein),在炎症、各种病因的感染、创伤、组织损伤及恶性肿瘤时血浆内饰 水平明显升高,但在血管内溶血及肝功能衰竭时血浆水平明显下降。 谢勇等用免疫荧光双标记法观察到表皮LC内有Hp蛋白。并且,他们 还发现如果将含有LC的表皮放在培养液内培养几天,LC内的Hp蛋白会 迅速减少,除非向培养基内加人人血清或Hp纯品。以上实验结果提示LC 可能自身不能合成Hp。 但是,有关人皮肤(表皮、真皮)中Hp mRNA或蛋白表达研究目前尚未 见报告。D’A二iento等曾发现在小鼠全层皮肤中有Hp mRNA表达,但没 有进一步明确其在表皮及真皮中的分布。 为了明确正常人皮肤是否有合成Hp的能力,我们做了如下工作: 1.用RT一PCR法检测了14例正常人皮肤(表皮及真皮)中Hp mRNA 表达; 2.用原位杂交方法检测了Hp mRNA在正常人表皮各种细胞中的表 达; 3.用RT一PCR及原位杂交法分别检测了Hp mRNA在人KC细胞系 HaCaT细胞中的表达; 4.用免疫组织化学法及Westem免疫印迹法检测了正常人表皮及 HaCaT细胞中Hp蛋白的表达。 材料和方法 一、标本资料: (一)正常人皮肤标本:22例正常人皮肤标本均取自于整形美容手术 中。 1.用于RT一PCR的标本14例。部位:包皮3例,面部4例,胸部5例, 腹部1例,臀部1例。其中,男7例,女7例。年龄:29一54岁,平均年龄: 39.8岁。 2.用于原位杂交及免疫组织化学染色的标本8例。部位:面部3例, 胸部5例。其中,男3例,女5例。年龄:22一51岁,平均年龄:38.875岁。 (二)HacaT细胞:是1 988年由Fusenig等从正常人躯干皮肤中分离并 培育的人KC细胞系,2000年10月由何春涤教授从德国Free Universityof Beilin引进并冻存于液氮中。使用前复苏并培养1周,取1 xl护个细胞用 于实验; (三)肝HePGZ细胞由华中科技大学同济医学院龚非力教授于2001年 6月惠赠,冻存于液氮内。使用前复苏并培养1周,取1 xl护个细胞用于实 验。 二、RNA提取及翩A浓度测定: 1.皮肤组织RNA提取:用EDTA一N、液分离表皮及真皮,用Trizol总 RNA提取试剂盒提取各份表皮、真皮标本总RNA。 2.细胞RNA提取:分别取1 x106个HacaT细胞及1 xl护个肝H叩G2 细胞,用Trizol总RNA提取试剂盒提取各份细胞总RNA。 3.提取的RNA用紫外分光光度仪测定在260nln及Zsorun处的光密度 (oPtic滋density,oD)值,并根据此OD值计算RNA的浓度和纯度。 三、引物设计: Hp引物采用以人Hpp链cDNA序列为模板设计的一对引物,产物大 小为197bp; PCR内对照采用人p一球蛋白(p一globin)引物对GHZo/PC04,产物大 小为286bpo 四、RT一PCR: 1.用Rav逆转录酶将各份表皮、真皮及HaCaT细胞、肝HePGZ细胞总 RNA逆转录为cDNA; 2,用Hp引物对及GH20/PC04引物对,PCR扩增各份表皮、真皮及 HaCaT细胞、肝HepGZ细胞的eDNA; 3.设立阴性对照:用各份标本的RNA代替模板cDNA进行PCR扩增; 4.设立空白对照:用灭菌双蒸水代替模板cDNA进行PCR扩增。.
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:R751

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