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《中国医科大学》 2003年
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部分变性高效液相色谱法检测胃癌组织、血浆及腹腔冲洗液中基因突变的研究

鲁翀  
【摘要】: 目的 变性高效液相色谱(denaturing high performance liquid chromatography,DHPLC)技术是近年来发展起来的一项新技术,其检测DNA序列的变异的主要原理是:存在突变的靶序列与野生型序列经过变性和复性处理,能杂交形成不完全互补的异源双链DNA,其变性温度略低于能够完全互补的同源双链DNA,利用部分变性的温度条件下,异源双链与同源双链融解温度的差异使色谱固定相保留它们的能力有所不同,根据柱上的保留时间分辨异源双链与同源双链,从而识别变异型。现有的报道认为,DHPLC可以快速地自动检测单个或多个碱基的置换以及小的插入和缺失,较以往多种检测方法均更加敏感特异,而且可检测的片段大小范围更广,可直接检测未做特殊处理PCR扩增产物,价格至少比测序等检测突变方法低廉10倍,平均8分钟即可检测一个样本,更重要的是:基本实现自动化操作,从而可从大量样品中快速搜索出未知的变异型,节约人力、物力和时间。本研究通过应用该技术检测胃癌组织、血浆及腹腔冲洗液中相关基因突变,探讨了其在检测实体肿瘤体细胞突变中的一些应用特点,阐明所检测的相关基因在胃癌中表达的意义,拟建立一种快速、方便、准确地筛查胃癌组织、血浆及腹腔冲洗液中基因突变的新方法。目的:(1)探讨将胃癌组织标本中提取的DNA,通过PCR扩增后,不与野生型DNA混合,直接应用DHPLC检测是否可行;比较两种选择DHPLC检测温度的主要方法,探讨如何更好的选择检测温度;应用普通Taq酶扩增的PCR产物进行DHPLC检测时,如何避免杂质峰的干扰。(2)检测p53基因及新近发现的CHK2基因、ST7基因等抑癌基因在胃癌中的表达,并阐明其意义。(3)探讨胃癌患者血浆DNA中扩增目的片段的可行性,建立一种快速检测血浆及腹腔冲洗液中DNA突变的新方法。 方法 1标本采取:所有39例标本均来自2001年9月一2002年8月于中国 医科大学附属第一临床学院肿瘤科行胃癌手术者。分别取癌组织、正常粘 膜、血浆及腹腔冲洗液标本。 2 DNA提取:胃癌组织、正常粘膜及腹腔冲洗液沉渣中DNA的提取,应 用常规酚抓仿法;血浆标本中DNA提取步骤主要依照QIA别mp DNA Blood Midi Kit说明书。 3 PCR扩增:应用普通介q酶分别对所检测基因相应外显子进行扩增, 扩增后作变性复性处理以保证充分形成杂合双链,不做其他特殊处理。 4 DHPLC温度选取及检测:结合2种常用方法,选取适当检测温度。适 当调节B液浓度,保证检测峰出现时间适当。每例样本检测时,注意与相 应正常粘膜标本同时检测。胃癌组织DNA扩增后不加人野生型DNA直接 进行检测。 5测序验证:对DHPLC检测出的与正常粘膜相比呈现异常峰型者,重 新扩增50林护CR产物,经T么kara DNAFr咫卿entpur访傀石。n‘t ver 2.0纯化 后进行测序。 实验结果 1在检测胃癌组织体细胞基因突变中的应用 同时平行检测39例胃癌组织及其相应正常粘膜组织,共发现呈异常 DHP砚峰形者9例,应用DHPLC检测p53基因突变的突变率为21%(8/ 39)。分别应用目前常用的两种判断检测温度的方法进行了检测,一种是 使用St翻而记大学网页上提供的计算软件直接给出融解温度(方法1),另 一种是应用DHPI刀仪随机携带的Wavemake衅.1融解曲线,结合操作者使 用经验判断及摸索确定检测温度(方法2),两种方法提供的温度均能全部 检出上述9例异常峰型。使用方法2较方法1少检测了2个温度。分别对 峰型异常者重新进行检测,分别检测出峰型发生改变的最低温度和最高温 度,结合测序结果发现,单碱基改变的异常峰型可检出的温度范围最小为 2.4一3.5℃,平均2.97℃。杂质峰出现范围介于2.5一3.smin之间,基本不 随温度及B液的浓度梯度改变而改变,目的峰随温度增高和B液浓度的增 高而前移,可以通过改变B液的浓度梯度避免杂质峰的干扰。 2胃癌组织中抑癌基因p53、517及CHKZ突变的检测 8例户3基因突变分别位于外显子5、6、7、8,其中3例突变既往未见报 道。(参见European Bioinformaties Institute,EBI)。本研究中,P53基因在 肠型胃癌中突变率40%(6/l5)明显高于弥漫型胃癌8.33%(2/24)(p0. 01)。分别扩增CHKZ基因的2个外显子和S’I7基因的4个外显子,应用 DHPLC检测所有39例胃癌组织及相应正常粘膜标本,均未见异常峰型。 3胃癌病人血浆及腹腔冲洗液中户3基因突变检测 提取8例在胃癌组织标本检出户3基因突变的病人血浆中DNA,应用 与组织中检出突变所在的相应外显子引物进行扩增,其中4例可扩增出相 应目的片段,与正常粘膜扩增出的野生型片段及癌组织扩增出的突变片段 同时进行DHPLC检测,均未发现明.显异常峰型。对8例腹腔冲洗液沉渣进 行DNA提取,及对相应外显子进行扩增,全部扩增出目的片段,与正常粘膜 扩增出的野生型片段及癌组织扩增出的突变片段同时进行DHPLC检测,其 中一例出现异常峰型。经测序证实与原发胃癌组织中突变一致。 讨论 1 DHPLC工作原理决定了其在检测实体肿瘤标本的体细胞突变时,可 能受到一定的限制,因为实体肿瘤组织中非肿瘤细胞的含量多少不等,很难 保证杂和性异
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:R735.2

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【参考文献】
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