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《中国医科大学》 2004年
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颌下腺组织工程生物衍生支架材料的制备及生物学性质的实验研究

邓春富  
【摘要】: 实验目的 由于各种疾病所致的涎腺分泌功能丧失,在临床上引起严重的口干症状及干燥综合症,给患者带来极大痛苦,严重影响患者的生存质量,至今尚无良好的治疗方法。组织工程学概念提出后,应用颌下腺组织工程的方法,构筑颌下腺组织器官,为治疗涎腺功能丧失所致的口干提供了新的思路和方法。在涎腺组织工程研究中,作为种子细胞附着、增殖、分化提供营养的细胞外基质支架材料,是组织工程研究的重点内容。目前常用的PGA、PLA等支架材料虽然可以起到细胞代谢场所作用,但是由于其本身为人工合成的高分子材料,属于异物,难免会引起机体的免疫排斥或感染。因此,寻找纯天然的生物衍生支架材料的研究受到该领域学者的极大重视。 本研究的目的是利用异体颌下腺组织,经过多步骤的脱细胞处理,获得纯天然的生物衍生支架材料。通过组织学和组织化学研究,分析脱细胞后的生物衍生材料的组织成分;扫描电镜下观察支架材料的结构特点;通过体内、体外的实验研究,分析颌下腺脱细胞生物衍生支架材料的组织相容性和细胞相容性;用培养优化的颌下腺细胞进行复合培养,观察细胞在支架材料上的生长情况;为颌下腺组织工程寻找合适的支架材料。 实验方法 1.应用化学除垢剂及酶消化的方法,对颌下腺组织进行脱细胞处理,制备纯天然的生物衍生支架材料。 2.比较不同浓度TritonX-100对颌下腺组织进行脱细胞作用的影响。 3.应用组织学及组织化学的方法,对制备的颌下腺生物衍生支架材料的基质成分进行分析。通过扫描电镜观察颌下腺脱细胞基质支架材料的组 织结构特点,并测量其孔径大小,同时计算其孔隙率。 4.制备领下腺脱细胞基质支架材料的浸提液,通过急性全身毒性试验, 分析脱细胞后的生物衍生支架材料对机体的毒性作用。 5.通过体内埋植试验观察领下腺脱细胞基质支架材料对组织的影响, 判断该支架材料的组织相容性。 6.MTr比色法检测领下腺细胞与支架材料体外复合培养第7天时的 吸光度值(OD值),测定波长为490nm,检测细胞的存活率,通过计算细胞 的相对增殖百分率,判断该支架材料的细胞相容性。 7.应用胰酶消化法进行领下腺细胞的分离、纯化,然后进行领下腺细胞 的原代和传代培养,倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态结构。 8.将传代培养的第2代细胞与领下腺脱细胞基质支架材料体外复合培 养,第3、5、7天时,通过扫描电镜观察领下腺细胞在支架材料上的生长情 况,细胞的表面形态及结构特点。 实验结果 一、领下腺脱细胞基质(Submandib己ar Gland Aeellular Ma‘x,SGAM)支 架材料的成分分析 1.组织形态学观察:1%TritonX一100脱细胞后,光镜下见细胞轮廓存 在,细胞外观形态无明显变化。但细胞核有的固缩,有的碎裂,不规则,细胞 核排列无序,呈现拥挤状态;而3%Tritonx一100脱细胞后的支架材料,领下 腺细胞成分完全消失,光镜下见不到细胞核形态,粉红色的胶原纤维排列较 疏松,可见细胞脱除后遗留的陷窝,呈筛网状结构。 2.透射电镜观察:1%TritonX一100脱细胞后,透射电镜下见细胞膜破 损,细胞器破坏、破碎,染色质凝集,形成多个散在的碎块,有的细胞核浓缩, 并可见到半月状的凋亡小体。3%TritonX一100脱细胞后,细胞器及细胞核 消失,只见残留的细胞轮廓,周边可见不同方向走行的胶原纤维断面。 3.扫描电镜观察:1%TritonX一100脱细胞后,细胞轮廓无明显改变,但 其表面细胞膜被破坏,表面不光滑,呈蜂窝状改变。3%TritonX一100脱细 胞后,见细胞完全消失,只残留空虚的陷窝,呈大小不等的坑穴状。基质胶 原纤维粗细不等,不同层面的胶原纤维走向不一,相互交错呈网状结构。经 测定其孔径在巧o一300卿之间,孔隙率为70%士7.25%。 4.免疫组化检测:领下腺脱细胞基质支架材料中,领下腺细胞成分被完 全脱除,在保留下来的网状结构的框架中,其主要成分为I、n、111型胶原蛋 白及纤维粘连蛋白,这些蛋白成分在脱细胞过程中没有丢失。而作为支架 材料的主要成分保留下来,为细胞的附着、增殖、分化和营养代谢提供了良 好的环境和场所。 二、领下腺脱细胞基质支架材料的毒理试验 1.急性全身毒性试验:按照生物学评价试验的要求及标准制备SGAM 支架材料的浸提液,通过大鼠尾静脉注射24h、48h及72h后,大鼠体重均呈 增长趋势,反应正常,未发现中毒反应和死亡,与生理盐水阴性对照组相比 较无差别。 2.体内植人试验:植人术后1周,手术创口愈合良好。植入后2周时, 在植人的SGAM支架材料周围有成纤维细胞包绕,但未形成纤维囊包裹, 植入物易取出;镜下可见有较多中性粒细胞及少量淋巴细胞浸润,分泌胶原 纤维。4周时,植人物周围可见一薄层包裹着半透明的纤维膜,镜下可见中 性粒细胞开始减少,淋巴细胞无明显增多,纤维膜与周边组织分界清楚。8 周时,纤维膜不再继续增厚,且膜密度增大,有变薄趋势,中性粒细胞及淋巴 细胞减少,偶可见到吞噬细胞,植人物体积明显变小,有吸收倾向。在空白 对照组,镜下
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R318.08

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