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《中国医科大学》 2004年
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马蹄内翻足大鼠模型建立及其胫骨后肌群蛋白质组分析

周海涛  
【摘要】: 目的 先天性马蹄内翻足是一种较常见的先天畸形,患儿一出生即表现为跟骨内翻,前足内收,跖骨旋后,踝关节下垂形成马蹄,以致行走时足外侧缘着地。畸形不影响患儿生存和生育,但严重影响其生活质量。马蹄内翻足的病理改变在神经、肌肉、骨骼、软骨及软组织方面均有表现。关于马蹄内翻足的发病机制存在宫内压迫、发育停滞以及遗传学说,但都缺少足够明确的证据。遗传流行病学研究表明遗传因素是马蹄内翻足发病重要因素。由于患儿标本难以取得,且存在加重患儿损伤的风险,建立马蹄内翻足动物模型对深入研究该病具有重要意义。 一切生命活动和生命现象最终要和蛋白质相联系,蛋白质才是生命的直接体现者。蛋白质组学是一个新兴的研究领域,研究特定病理生理条件下某种组织细胞的全部蛋白质。本实验拟从蛋白质入手,首先查找相关蛋白,然后据此寻找马蹄内翻足有关基因。 蛋白质组分析的首要步骤是将来自于全细胞、组织或生物体中多达数千种混合蛋白质进行分离。双向电泳技术是目前分辩率最高也最常用的工具,在寻找未知蛋白质、蛋白质组的全景分析、表达特性分析等方面有独特的功效。通过双向电泳对蛋白质多肽点进行高度分离纯化,辅之以质谱等鉴定技术,并结合生物信息学技术,可用于规模化未知蛋白质的筛查和鉴定。 因此,本研究首先利用全反式维甲酸(All-trans retinoic acid,ATRA)诱导孕鼠,探讨ATRA诱导马蹄内翻足样畸形的最佳剂量,建立稳定的马蹄内翻足动物模型,为深入研究马蹄内翻足发病机制提供物质基础;同时选择正常Wistar大鼠胚胎肌组织蛋白质组进行双向电泳分析,建立胚胎肌组织双向电泳技术平台;随后利用双向电泳分离模型鼠及正常鼠肌肉蛋白质组, 比较模型与正常对照蛋白质点的差异,通过质谱测定结合生物信息学手段 鉴定差异蛋白,为马蹄内翻足的研究提供基础资料。 实验方法 1.马蹄内翻足大鼠胚胎模型建立 (1)将孕10d的Wistar近交系大鼠随机分为对照组和4个实验组, ArrRA(40m扩nil)用前混悬于矿物油中,用灌胃法按体重分别给予实验组 大鼠一Zom含‘kg、13om岁kg、135m扩kg、x40 mg/kg,对照组(0 mg/吨组)给 予140m扩kg组相应体积矿物油。 (2)孕21d剖腹取出胚胎,通过胎鼠畸形情况的检查和结构畸形病理 分析确定内翻足样畸形(足前部内收内旋,足跟内翻,棵关节下垂,棵角大 于130”)及其他畸形的发生情况,并记录死胎,吸收胎数和活胎体重身长, 经数据统计处理确定维甲酸最佳诱导剂量。 (3)分别制作马蹄内翻足畸形鼠和正常对照鼠脊髓、椎骨和胫骨后肌 群石蜡切片。参照试剂盒DeadEndT“而orometric TuNEL衍stem说明,对切 片TuNEL法标记作凋亡分析。 2.胎鼠肌组织蛋白质组双向电泳,每份样品重复进行三次。 (l)取正常孕Zld胎鼠,实体解剖镜下胫骨后肌群,吸除液体,冰浴中 捣碎,加少量裂解液研磨成匀浆,补加裂解液至lmF50mg组织,混匀,室温 放置l小时,离心取上清,定量。 (2)等电、聚焦使用PROTEAN IEF等电聚焦仪。上样量pH3一10 IpG胶 条为0.5 mg,pHS一IpG胶条为1.omg,上样体积为350诅。SOv,13h;250v, 30min;IO00v,lh;最后10 000v聚焦60(X心vh。 (3)平衡与SDS电泳经两步平衡后SDS电泳,30v,30分钟后加压至 120v,直到嗅酚蓝泳出玻璃板前缘为止。 (4)银染及考玛斯亮蓝染色,图像利用PDQuest7.0进行分析并标识白 点分子量和等电点。 (5)选清晰匹配点手工切取并进行质谱分析。数据查询使用Peptldent 搜索Swiss~Prot,同时利用Maseot或MS一Fit辅助搜索NCBInr。 3.模型鼠与正常鼠肌肉蛋白质组差异分析 (l)分离模型胎鼠及正常对照胎鼠胫骨后肌群,提取蛋白,等电聚焦, SDS电泳,考马斯亮蓝R一50染色,利用PDQuest软件对图像进行分析。 (2)差异分析重点分析高差异蛋白,包括未匹配斑点(仅在正常鼠出 现,或仅在模型鼠出现)和上调10倍以上,上调5一10倍,下调5一10倍和 下调10倍以上斑点。 (3)选取8个差异点作质谱测定,选取原则是:可重复,非边缘化,斑点 清楚,匹配关系肯定,肉眼可见。所获质谱用Peptldent,Masoot,MS一Fit三个 不同的查询软件搜索蛋白质序列数据库。搜索结果为同一蛋白时,再综合 表观分子量、等电点判定结果。 实验结果 1.维甲酸实验组可见包括马蹄内翻足样畸形在内的多种畸形。畸形 发生率随剂量增高而增加。135m岁kg组马蹄内翻足样畸形发生率为 60.98%,14Dm留kg组发生率为68.18%。140m扩kg组发生马蹄内翻足样 畸形的胎鼠多数伴发其它畸形且表现胚胎毒性。135m留kg组单纯马蹄内 翻足样畸形的发生率最高,达29.27%,胚胎毒性轻微。120m扩kg组与130 m扩kg组马蹄内翻足畸形及其它畸形发生率很低。 足大体组织切片显示,典型畸形足与对照相比在横截面上足前部明显 向内倾斜,距骨变小呈楔形位于跟骨后内侧;距骨前后轴缩短,呈菱形;胫骨 和附骨趋向同一解剖面;距骨、跟骨前部均向内偏。胫骨躁趋向于距骨的掌 面。排骨跺位于较后的位置,甚者与跟骨形成
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R-332

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【参考文献】
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