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《中国医科大学》 2004年
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一个新的T细胞活化分子(CD226)与HIV感染/艾滋病的相关性研究

叶晓卉  
【摘要】: 实验目的 1.明确HIV/AIDS患者T淋巴细胞以及自然杀伤(NK)细胞膜表面CD226(mCD226)分子表达水平,与其它免疫活化指标水平变化相比较的特点; 2.明确HIV/AIDS患者血浆中可溶性CD226(sCD226)分子水平与mCD226表达变化的相关性; 3.明确mCD226/sCD226分子水平在评价HIV感染者机体免疫状态和疾病进程中的临床意义。 实验材料与方法 一、实验材料 1.材料: LeoAl(CD226-FITC)单克隆抗体(mAb)由第四军医大学免疫学教研室提供,抗CD3、CD4、CD8、CD16、HLA-DR的mAb、CD4 T淋巴细胞绝对计数试剂盒(TruCount~(TM))以及流式细胞仪(FACSCalibur)均为美国Becton Dick-inson公司产品。HIV-1/2抗体和HIV-1 p24抗原检测试剂均为荷兰Orga-non Teknika公司产品,免疫印迹(WB)试验试剂为新加坡Genelabs Diagnos-tics公司产品。RPMI 1640为GIBCO公司产品,PHA和rIL-2为Sigma公司产品,其它化学试剂均为国产分析纯。 2.研究对象: 34例HIV-1抗体阳性病例均经中国医科大学第一临床学院艾滋病研究室WB试验确认,其中男性26例,女性8例,年龄范围在18-40岁,根据1993年美国CDC制定的艾滋病监测病例分类及扩大的诊断标准,无症状 HIV感染(AS)组(CD4+T淋巴细胞妻200个/闪)25例,AIDS组(CD4+T 淋巴细胞200个/川)9例。感染途径包括输血、静脉注毒和性传播。所 有外周静脉血均在未接受抗逆转录病毒治疗前采集并保存,EDTA一KZ抗凝。 正常对照组为随机抽取的26例健康人,男性16例,女性ro例,年龄范围在 1942岁。 二、实验方法 1.cD4+T淋巴细胞绝对计数: 参照美国CDc“HIV感染者cD4+T细胞的检测指导方法〔‘,〕”,采用溶 血一免洗法TruCOUNTTM进行FITC/PE/Pe尤P三色荧光标记染色:T加COU- NTTM测试管中,加20闪TriTEsT试剂(CD4/CDS/CD3诚b)和50闪抗凝 血,孵育巧而n后再加450闪免洗溶血素,孵育巧一30而n。流式细胞术 (FCM)检测和分析:应用M血isET软件进行,得到CD3+T细胞、CD4+T 细胞、CDS十T细胞绝对数以及相对比值。 2.淋巴细胞膜表面CD226(mCD226)分子的检测: 采用三荧光染色标记体外培养细胞、HIV感染者以及健康对照的全血 细胞,按CD226/CDS/CD3,CD226/CD4/CD3,HLA一DR/CDS/CD3,HLA- DR/CD4/CD3,CD226/CD16/CD3、CD226/CDS/CD3和CD226/CD咚/CD3等 mAb组合给试管编号并在管中分别加人一定量的上述mAb;再加人全血 80闪或细胞悬液,室温保存30而n;加2一而溶血素,室温保存5一10min至完 全溶血;重复洗细胞3次后,加0.5而1%多聚甲醛固定细胞,避光保存, FCM检测与分析。应用CellQuest软件。用前向散射角(FSC)及侧向散射 角(SSC)确定淋巴细胞群,再分别以CD3+细胞、CD3·CD16+、CD3一CDS+ 淋巴细胞为门,分析表达CD226的细胞,以阳性百分率(%)表示,并根据淋 巴细胞数计算出特定细胞亚群绝对数(。ells/~,)。 3.双抗体夹心EUSA法检测可溶性CD226(sCD226)分子水平: 玩。Al包被EllSA板,过夜。向板中加人标准品CD226/F。融合蛋白 和待测样本,孵育45而n,再加人HRP标记的mAb,孵育45min,加人底物 TMB显色,2.smoFL HZSO4终止反应。测定OD4s。吸光度(A),以标准品的 A值和相应的浓度作标准曲线;将待测样本的A值与标准曲线相比,计算 待测样本的sCD226浓度。 4.HIV一1 503体外活化外周血单个核细胞(PBMC): Hlv一1。。3株和MT4细胞系由中国疾病预防与控制中心参比实验室惠 赠。按常规传代并测定感染滴度(TCID50)。分离健康人PBMC,调整细胞 浓度后分组用于实验,pBMC与HIV一1 503(125 TCID,)共孵育Zh后,接种 于细胞培养板,作为染毒组,设立不染毒或不加PHA的对照组。在不同时 间点收集培养细胞进行免疫荧光染色,FCM分析,收集细胞培养上清检测 SCD226的浓度,同时测定HIV一1 p24抗原,以确定细胞的病毒感染效果。 5.统计学分析: 用SPSS 10.0软件对实验数据进行分析。t检验进行As/AIDS患者和 健康对照组间sCD226、mCD226均值比较。Spe一相关分析sCD226分 子水平与CD226+T细胞、CD4+T细胞百分率的相关性。 实验结果 一、HIWAIDS患者T淋巴细胞CD226的表达水平 经FCM测定外周血T淋巴细胞及其CD4+T细胞、CDS+T细胞亚群 中的CD226抗原表达可见:AS组和AIDS组CD3+T细胞中CD226+细胞 百分率为41 .6土31 .4%和47.3土17.2%,明显高于健康对照组22.6*16. 7%(p0 .01);CD4+T细胞和CDS+T细胞亚群中CD226+细胞百分率 均显著高于健康对照(p0.01),但与CD3+T细胞中的CD226表达水平 没有显著差异;CD4+T细胞与CDS+T细胞亚群,AS组与AIDS组CD226 +细胞百分率差异均不显著。 二、HIWAIDS患者T淋巴细胞CD226和HLA一DR的表达 CD226+T淋巴细胞百分率在AS组(41 .6士31 .4%)和AIDS组(47.3 士17.2%)均显著高于健康对照组(22.6士16.7%),HLA一DR+T淋巴细胞 百分率只在AIDS组(44.2土24.1%)与健康对照组(14.1土5.5%)差异显 著,AS组(19.7土6.8%)与健康对照无显著差异。 三、人PBMc CD226和HLA一D
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R512.91

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【参考文献】
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