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《中国医科大学》 2004年
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胎鼠急性缺血/再灌注损伤后肾脏血管紧张素Ⅱ受体2的变化及其在肾小管上皮细胞凋亡中的作用

李冬  
【摘要】: 前言 新生儿急性肾损伤是新生儿危重和致死的主要原因,常由新生儿窒息、冷伤、休克、溶血、失血等多种原因引起,其重症导致新生儿急性肾功能衰竭(ARF),并进一步继发多脏器功能衰竭而致新生儿死亡。其中围生期窒息是发病的主要危险因素。 围生期窒息的主要病理生理特点是:缺氧导致的组织细胞一系列代谢紊乱和器官损伤,肾脏因其组织高代谢率而成为主要损伤对象。围生期窒息主要发生在宫内,其中产前、产时因素占80%-90%,由于成功地建立宫内缺血再灌注损伤模型,在此研究领域取得了一定的进展。 血管紧张素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ,AngⅡ)是肾脏最主要的有生物活性的物质,通过受体发挥作用,根据其药理特性的不同主要分为两个亚型:1型(AT_1受体亚型),2型(AT_2受体亚型),已知传统的AngⅡ的主要作用都是通过AT_1受体进行的,而对AT_2受体的功能尚不完全清楚。已明确AT_2受体在胚胎期高表达,生后迅速下降,可见其在胚胎发育中的作用。有研究表明:在一些病理情况下,已经不表达或表达很少的AT_2受体又可以重新表达或表达增强,提示该受体可能参与了一些疾病的病理过程。 缺血再灌注肾损伤的病理过程为:在缺血早期肾素-血管紧张素系统发挥作用,产生缩血管作用,随后内皮损伤、进而细胞粘附产生炎症反应,导致细胞的损伤甚至死亡(坏死或凋亡)。作为AngⅡ的一个在胚胎期高表达的受体,AT_2在宫内缺血再灌注性损伤后胎鼠肾脏中的表达是否出现变化?尚未见研究。研究表明:凋亡是缺血再灌注损伤的关键环节,以往对凋亡的研究多在慢性缺氧或其它慢性损伤,胎鼠急性缺血再灌注损伤后是否也出现凋亡?未见此方面的研究。 体内实验,我们通过胎鼠宫内急性缺血再灌注损伤模型,用免疫组化技术结合RT-PCR分析了AT_2受体的表达,用TdT介导的生物素化-dUTP原位缺口末端标记(TUNEL)技术分析了肾脏细胞的凋亡,并用免疫组化染色半定量分析半胱氨酸蛋白酶32(Caspase-3)的表达。探讨了缺血再灌注肾损伤后AT_2受体的表达及凋亡细胞的变化,但二者之间的联系如何? 肾脏细胞尤其是对损伤最敏感的肾小管上皮细胞的凋亡是否由A飞受体介 导?体外实验,我们取新生大鼠的肾小管上皮细胞原代培养,传代后分别用 Angn及CGP一421 12A(选择性的ATZ受体激动剂)诱导,探讨不同药物在 不同浓度及不同作用时间对肾小管上皮细胞凋亡的影响,流式细胞仪分析 凋亡细胞指数,RT一PCR半定量分析A几受体的表达,进一步探讨A毛受体 在Angn诱导的肾小管上皮细胞凋亡中的作用。 材料和方法 一、体内实验部分 1.动物模型的制作 孕21天Wistal大鼠腹腔麻醉后,下腹正中开口,无创动脉夹钳夹一侧 供应子宫的动静脉血管,对侧未钳夹宫角的胎鼠为对照组(假手术组),钳 夹时间分别为5而n,巧而n,30而n,达到要求后,取下动脉夹行再灌注,再灌 注时间分别为O而n,3Omin,Zh,6h,24h。 2.标本采集及处理 满足要求后立即剖宫取鼠,断头处死,取出双侧肾脏,一196℃液氮中贮 存待检。各组分别取同一位置的冰冻肾组织,以CM(chicken musde,鸡肌 肉组织)为载体,制成组织微阵列,冰冻切片厚度为6林m,连续切片,分别用 冷丙酮及多聚甲醛固定,一20℃保存待检。切片剩余肾组织分别标记于一 80℃贮存待PCR分析。 3.实验方法 (l)HE染色:取一196℃冰冻肾组织,切片,苏木精染色,伊红复染,中性 树脂封片,光镜下观察形态学改变。 (2)免疫组化分析:分别选用特异的A毛受体抗体、Caspase一3抗体,用 链菌素亲生物素一过氧化酶法(S一P法)检测肾脏ATZ受体及CasPase一3 的表达和定位。 (3)末端脱氧核昔转移酶介导的缺口标记法(TUNEL):取肾组织切片, 固定后行TUNEL分析,测定肾脏细胞的凋亡。 (4)RT一PCR半定量分析:Trizol法提取总RNA,逆转录后,PCR扩增,日 一actin为内参照,半定量分析AT ZmRNA的表达。 4.统计学分析 数据用又士s表示,用SPSS for Windows ro .5软件对数据进行析因分 析,组间两两比较采用巧D法,单因素分析采用ANOVA法,P0.05为显 著差异界限。 二.体外实验部分 1.肾小管上皮细胞原代培养及传代 用机械研磨加酶消化法取新生Wistar鼠肾小管上皮细胞(Ren吐Tubu- lar CellS,RTCs),进行原代培养,待细胞融合后传代,实验用传代细胞。 细胞传代后,平均细胞于各皿中,分别加人不同浓度的Angn和 CGP- 42 1 12A(特异的ATZ受体激动剂)诱导细胞,在不同时间进行观察。 2.实验方法 (l)HE染色培养皿内铺片,待细胞爬满玻片后,取玻片HE染色,观察 细胞形态学。 (2)电镜收集细胞,固定后行电镜切片,电镜下观察细胞的超微结构。 (3)细胞免疫化学方法(CCH)用特异的Cytokerin一18抗体,利用CCH 技术,鉴定培养的肾小管上皮细胞;用ATZ受体抗体,分析细胞在用药物诱 导后ATZ受体的表达。 (4)TUNEL分析测定药物诱导前后细胞的凋亡。 (5)流式细胞仪分析收集细胞,PI染色,上流式细胞仪进行细胞凋亡测 定。 (6)RT一PC
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R363

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【引证文献】
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