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激素性股骨头缺血坏死血液生化学、影像学及病理学相关性的实验研究

董越  
【摘要】: 前言 股骨头缺血坏死(Avasculaur necrosis of femoral head,ANFH)是一种临床常见病,世界约有2000万患者。在疾病的晚期可以导致股骨头软骨塌陷,直接影响着病人的生活质量。在ANFH众多危险因素中,最常见的是激素的长期大量应用。激素性ANFH的发生是系统和局部因素共同调节的结果,其确切的发病机制还不明确,目前较普遍接受的观点是脂肪代谢紊乱、前凝血状态及血管内凝血、激素的毒性作用、血管炎和骨内压升高等机制,这些机制往往是相互联系,互成因果关系。其中细胞因子的局部作用被认为是最重要的因素之一。已经有学者发现血管内皮细胞生长因子(VEGF)在激素性ANFH的发生、发展和修复过程中起着重要的作用。 股骨头内血供的减少是ANFH早期病理学改变,对股骨头血供下降的发现是ANFH早期诊断、指导治疗、判断疗效和预后的关键。目前主要应用核素显像、MR对股骨头血供进行评价,但这些检查方法特异性差且价格昂贵等缺点使我们需要寻找一种新的方法能够早期评价股骨头血供变化。近来出现的CT灌注成像也是基于同位素显像原理的基础上发展起来的一种评价组织微循环的影像方法。它是一种功能成像,可以获得感兴趣区组织的血流量、血流平均通过时间等反映微循环变化的指标,目前国内外主要用于脑、肺、肝脏和肾脏等实质器官疾病的研究,但还没有骨骼系统疾病的研究报道。 本研究通过制作家兔激素性ANFH模型,连续观察在给予激素的不同时间里,血液生化学、MSCT灌注成像及病理学的变化规律。确定激素性ANFH模型MSCT灌注成像特征,VEGF在股骨头内不同细胞的表达情况。研究血液生化学、MSCT灌注成像和病理学改变的相关性。进一步探讨ANFH的病理生理机制,为其早期诊断和疗效及预后的评价提供新的途径。 材料与方法 一、动物模型制作 选取成年中国白兔22只,体重2.5一3.skg,雌雄不限,随机分为两组, 实验组:18只,对照组:4只。实验组每周给予两次臀肌注射smg/kg甲基强 的松龙唬拍酸钠;同时给予青霉素20万单位/kg臀肌注射预防感染,连续8 周。对照组仅给予青霉素20万单位/kg臀肌注射。所有动物相同方式饲 养。分别在2、4、6、8周周末实验组处死4只,对照组处死1只。 二、血液生化检查 实验的每周末所有动物禁食水12h,随机选取实验组8只和对照组1 只动物抽取耳缘静脉血7血,进行血脂和血液流变学检查。 观察血脂和血液流变学随给药时间的变化,包括甘油三脂(TRIG)、胆 固醇(CHOL)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、全血粘度、血浆 粘度、卡松粘度、卡松屈服应力、RBC压积、RBC聚集指数、RBC变形指数、 RBC刚性指数、RBC计数、RBC电泳时间。分析血脂和血液流变学指标的 相关性。 三、MSCT灌注成像 应用Philip公司Mx8000多层螺旋CT机(MSCT)进行CT灌注检查。 给药后2、4、6、8周周末随机选取实验组4只动物、对照组l只动物进行 MSC’r灌注检查。 应用2%的硫喷妥钠腹腔注射麻醉动物。CT平扫后,对选定的连续4 层进行灌注扫描;应用高压注射器以lml/s速度,经耳缘静脉注人欧乃派克 350 mgF而,剂量ZmFkg,在注射造影剂同时开始扫描;共扫描100层,数据 采集时间0.755,循环时间2s。 应用Mx8000工作站的Funetional一CT软件进行图像后处理。选取可 以完全显示股骨头断面的两个层面,取右侧股骨头旁动脉作为参照血管,得 到动脉的时间一密度曲线,生成伪彩图。于股骨头皮质下区选取直径约5 一7~的圆形宜oI,获得ROI的时间一密度曲线,计算双侧股骨头的灌注 量、峰值增强值、达到峰值时间、平均通过时间。分析MSCT灌注参数与血 液生化指标的相关性。 四、组织病理学检查 应用过量硫喷妥纳处死动物。取双侧股骨头于10%的中性甲醛固定, 10%硝酸脱钙6一7天。大小转子间股骨头正中纵行切开,取5~厚组织, 石蜡包埋后,切取厚7林m的石蜡切片,进行现染色。 免疫组化染色:切取厚7林m的组织薄片,多聚赖氨酸贴片;浸人二甲苯 及酒精中脱蜡至水,3%HZ 02灭活内源性酶,蒸馏水冲洗。应用SABC法进 行免疫组化染色;滴加DAB显色,镜下控制显色时间;流水冲洗,滴加苏木 素复染,酒精和二甲苯脱水、透明、封片。 HE切片:观察不同给药时间股骨头内细胞成分的变化情况。选取5个 高倍视野(400倍),计数每个视野股骨头软骨下区平均空骨陷窝率(空骨陷 窝数/骨陷窝总数x 100%)、软骨下区血管数,取平均值。 免疫组化染色切片:观察不同给药时间股骨头内VEGF的表达情况;高 倍视野下(400倍)沿骨小梁表面计数50个成骨细胞中的阳性细胞数, VEGF成骨细胞阳性率二阳性成骨细胞数乃0 x 100%,3次取平均值;计数 每个高倍视野软骨细胞中的阳性细胞数,VE邵软骨细胞阳性率=阳性软 骨细胞数/软骨细胞总数x 100%,5次取平均值。对血液生化学、MScr灌 注成像、病理各指标进行相关性分析。 五、统计学分析 所有测量结果用均数士标准差表示。实验组与对照组各测量结果均数 比较应用t检验或t‘检验。对血液生化学、MScT灌注成像、病理各指标与 给药时


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