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《中国医科大学》 2004年
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TGFβ_1诱导纤维粘连蛋白表达促进肝纤维化的研究

李智伟  
【摘要】: 目的 在我国慢性乙型肝炎是引起肝纤维化及肝硬化的主要原因,是严重危害人民健康的疾病,但是其引起肝纤维化的机制仍不十分清楚。本项研究通过对68例慢性乙型肝炎患者肝脏病理及血清转化生长因子β_1(transforming growth factorβ_1,TGFβ_1)、纤维粘连蛋白(fibronectin,FN)、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)检测结果的分析来探讨其相互关系;同时采用RT-PCR、Western blotting、胶体金标记免疫电镜技术研究TGFβ_1刺激下体外培养的WB鼠肝脏上皮细胞(WB rat liver epithelial cell)FN、FNmRNA、FN的cAMP表达变化以及WB鼠肝脏上皮细胞凋亡的发生情况,阐明TGFβ_1与慢性乙型肝炎患者肝纤维化、肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)以外的肝非实质细胞FN表达及凋亡发生的关系,为深入研究慢性乙型肝炎肝纤维化的发生机制提供实验依据。 材料与方法 慢性乙型肝炎患者68例,男54例,女14例,年龄16-60岁。诊断符合2000年9月中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会联合修订的《病毒性肝炎防治方案》诊断标准。上述病例常规采静脉血10ml分离血清检测TGFβ_1、FN、ALT,并在超声引导下进行肝活体组织穿刺取肝组织标本,肝组织标本以10%甲醛固定做连续切片,常规做苏木精伊红(HE)及网状纤维和Masson三种染色,以准确判断肝内炎症、肝组织结构改变及纤维化程度。人血清FN及TGFβ_1采用sigma公司提供ELISA试剂盒进行检测。 TGFβ_1刺激后WB鼠肝脏上皮细胞FN表达变化的研究,采用TGFβ_1与WB鼠肝脏上皮细胞共同培养0小时、4小时、8小时、24小时后弃去培养 液,先后加人裂解液100闪、PMSF4醉、Aprotininl闪作用数分钟后,将细胞 刮下收人微量离心管中,4℃,100009离心巧分钟,提取上清置一130℃冻 存。应用Westem blotting方法检测TGFpl刺激0小时、4小时、8小时、24小 时WB鼠肝脏上皮细胞的FN表达,获得电泳带应用天能GIS凝胶图象处 理系统进行半定量分析。 TGFpl刺激后WB鼠肝脏上皮细胞刚mR取A表达变化的研究,采用 TGFp,与WB鼠肝脏上皮细胞共同培养0小时、4小时、8小时、24小时后弃 去培养液,各加人Trizol reagentl而,摇均,放置5分钟,移人离心管中。加 氯仿0.4d混匀。4℃、120009、离心巧分钟;将上层水相液移至新离心管, 加异丙醇1 mFI耐Trizolreagent、混匀,室温下放置10分钟。4℃、1200鲍、 离心10分钟,弃液体。用75%酒精洗2次(离心120009、4℃、5分钟)。弃 酒精后放置室温下干燥约30分钟,用水溶解RNA。应用RT一PCR方法扩 增TGFp,刺激0小时、4小时、8小时、24小时WB鼠肝脏上皮细胞提取的 RNA,应用天能GIS凝胶图象处理系统对获得的FN mRNA电泳带进行半 定量的分析。 WB鼠肝脏上皮细胞内的cAMP以及在TGFp,刺激下WB鼠肝脏上皮 细胞凋亡情况,采用TGFp;与WB鼠肝脏上皮细胞共同培养O小时、4小时、 8小时、24小时后弃去培养液,每瓶加人2.5%胰蛋白酶与0.03%EDTAI:1 混合的消化液4nil进行消化后,移人离心管置4℃,13009,离心10分钟。 离心管中加人Hank,s液,13009,4℃,离心10分钟,重复两次。弃去上清,细 胞团块用戊二醛固定。常温环氧树脂包埋,制作厚约70nm的超薄切片,载 于200一300目圆孔的镍网上。应用胶体金标记抗体进行免疫组化染色后 电镜下观察。 实验结果 1.慢性乙型肝炎患者血清TGFp,、FN、ALT检测结果及与肝脏炎症活 动度、纤维化程度相关性研究 慢性乙型肝炎患者血清TGFp:、FN、ALT检测结果分别为:FN为525. 04土414.97;TGFp;为33.24士25.48;ALT为96.62士120.45。经SPSS软件 进行直线相关分析,慢性乙型肝炎患者血清TGFp:水平与血清FN,ALT水 平密切相关,相关系数分别为0 .338和0.336,P值分别为0.019和0.020。 FN水平与肝脏炎症活动度及纤维化程度密切相关,相关系数分别为0.341 和0.285,P值分别等于0.加7和0.025。表明慢性乙型肝炎患者血清 TGF日1水平与FN、ALT水平呈直线正相关;FN水平与肝脏炎症活动度及纤 维化程度呈正相关;而TGFp,与肝脏炎症活动度及纤维化程度无关。提示 TGFp:虽然是慢性肝炎患者肝纤维化过程中FN等ECM过度表达的重要原 因,但与纤维化程度并不平行,其作用并非在整个纤维化过程中持续存在。 2.TGFpl增加WB鼠肝脏上皮细胞内FN表达的研究 采用TGF日1与WB鼠肝脏上皮细胞共同培养0小时、4小时、8小时、24 小时后,WB鼠肝脏上皮细胞内FN检测值分别为巧6 .33土39.53、172.00土 31·24、235·67土62.66、191.67土22.50。表明TGFpl刺激后WB鼠肝脏上 皮细胞内F’N表达呈一过性增加,在8小时FN的水平达到高峰,之后开始 下降。经方差分析,TGFp:刺激8小时组FN值与刺激。小时组比较有显著 性差异,P值为0.016,而其他时间点无显著性差异。研总的F二4.650;P 二0.037;有显著性差异。说明TGFp;不仅可以诱导HsC表达FN,而且可以 刺激HSC以外的WB鼠肝脏上皮细胞等肝非实质细胞表达FN,是引起WB 鼠肝脏上皮细胞FN表达增加的原因。 3.TGFpl增加WB鼠肝脏上皮细胞内FN mRNA表达的
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R575.2

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