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《中国医科大学》 2004年
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β-连环素/T细胞因子4信号通路在非小细胞肺癌的研究

李春艳  
【摘要】: 目的 肿瘤细胞是由正常细胞恶性转化而来,其信号传导机制与正常细胞存在明显区别,其中既有量的差异,更重要的是质的不同。β-连环素/T细胞因子4(T cell factor 4,TCF-4)信号通路,是细胞生长、发育的关键性信号系统,且多与内胚源性器官相关。在大多数的结肠癌和一些胃癌、肝癌中该通路已被证实具有重要作用。β-连环素和TCF-4是该信号通路的两个重要信号分子。β-连环素作为多功能蛋白,一方面同E-钙粘连素结合形成细胞连接;另一方面,入核与TCF-4结合形成复合物,激活Wnt信号通路下游靶基因转录。尽管β-连环素在非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)中的表达已有报道,但其与NSCLC的相互关系、作用并未完全了解。而TCF-4作为具有高度保守的高迁移率组蛋白盒(high mobility groupbox,HMG BOX)的TCF家族的主要成员,在肺癌中的研究仅限于几个细胞系。本实验首先通过免疫荧光、免疫组化、RT-PCR技术分别观察β-连环素和TCF-4在NSCLC中的蛋白及mRNA表达,然后通过免疫沉淀和蛋白质杂交检测β-连环素/TCF-4复合体在NSCLC中的表达,初步探讨、分析β-连环素/TCF-4信号通路与NSCLC病理过程的关系。 方法 1 实验材料 60例NSCLC组织,8例癌旁正常组织取自中国医科大学第一附属医院胸外科2001年9月-2003年3月手术标本,均经病理诊断证实。一部分组织经石蜡包埋,用于免疫组织化学研究;一部分组织经组织包埋剂包埋,用于免疫荧光观察;另一部分组织经液氮冷冻后置于-70℃保存,用于RT-PCR和Western blotting分析。 .2实验方法 2.1免疫荧光:冰冻切片固定后,依次滴加p一连环素鼠抗人单克隆抗 体,荧光标记二抗,核复染,应用激光共聚焦显微镜观察肺癌组织内卜连环 素的蛋白分布。 2 .ZRT一PCR半定量测定:用试剂TRIZOL提取总RNA,一步法反转录、 扩增p一连环素和p一actin的mRNA,根据自动凝胶分析系统检测的扩增电泳 条带的整合光密度值,检测p一连环素mRNA的相对含量。 2 .3免疫组织化学:石蜡切片,用兔抗人代F4多克隆体、过氧化物酶 标记的链酶卵白素(SP)染色试剂盒检测TcF4的蛋白分布和表达,结合显 微图像分析软件分析冗F4的蛋白表达强度。 2.4RT一PcR半定量测定:用试剂TRIZOL提取总RNA,一步法反转录、 扩增TCF4和p一actin的mRNA,根据自动凝胶分析系统检测的扩增电泳条 带的整合光密度值,检测代F4 mnNA的相对含量。 2.5蛋白提取:应用超速离心将组织的细胞核、细胞浆的蛋白分离。 2 .6免疫沉淀和Westem bI0tting:用兔抗人代F4多克隆体和蛋白A将 p一连环素/TCF4复合物沉淀,复合物经聚丙稀酞胺电泳分离,最后经化学 发光试剂检测。 3结果判定及数据处理 3.1日一连环素的免疫荧光观察:以癌旁正常支气管上皮细胞膜的染色 强度为标准,将肿瘤组织染色情况分两类,一类为同一视野内肿瘤细胞染色 强度与正常支气管上皮细胞膜的染色强度相同的细胞数大于或等于50%, 另一类为小于50%。如果细胞核的轮廓或位置能从蛋白质阳性染色中分 辨出来,既判定细胞核表达阳性。 3.Zp一连环素的mRNA表达:p一连环素mRNA的相对含量进行样本均 数的t检验。p一连环素的mRNA表达在p一连环素细胞膜高、低表达组间以 及在p一连环素细胞核表达有、无组间的样本均数进行t检验。 3.3 TCF4的免疫组织化学观察:根据切片细胞核或细胞浆的阳性细 胞数将染色模式分为4类:仅细胞核染色或细胞核染色的细胞数多于细胞 浆染色的细胞数,仅细胞浆染色或细胞浆染色的细胞数多于细胞核染色的 细胞数,细胞核、细胞浆均染色且染色的细胞数相近,细胞核、细胞浆无染 色。各染色模式间进行犷检验。代表细胞染色强度的积分光密度值,进行 样本均数的t检验。 3. 4TCF4的mRNA表达:TCF4 mRNA的相对含量进行样本均数的t 检验。 3.sp一连环素/TCF4复合体的表达:免疫沉淀后蛋白质经电泳、转膜、 化学发光检测,胶片在92KD处有清晰条带,即判定复合体表达。 3 .6各检验的显著差异均设为95%。 实验结果 1100%正常肺组织具有p一连环素的细胞膜均一表达,37%NsCLC组织 内p一连环素细胞膜表达下降,100%NSCLc组织具有p一连环素细胞浆表 达,51%NSCLc组织具有p一连环素细胞核表达。 2正常肺组织内p一连环素mRNA低表达,NSCLC组织内p一连环素mR- NA高表达,且显著高于正常组织(0.28土0.20,0.11土0.08,p0.01);p- 连环素mRNA表达在NSCLC组织分型及组织分化之间无显著差异。p一连 环素细胞膜表达低(50%)的组内p一连环素mRNA表达显著高于p一连环 素细胞膜表达高(〕50%)的组(0.43土0.18,0.21土0.08,p0.01)。p一连 环素细胞核表达组的p一连环素mRNA水平与无p一连环素细胞核表达组的 p一连环素mRNA水平间无显著差异(0.32土0.19,0.32土0.15,P0.05)。 3正常组织内无可检测到的TCF4表达,85%NSCLC组织内TCF4表 达,且以细胞核表达为主。肺腺、鳞癌内TCF礴染色模式具有显著差异(才 二8.gP0.05);中、低分化肺癌组织的TCF礴表达强度显
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R734.2

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