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《中国医科大学》 2004年
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肾综合征出血热免疫诊断技术及其应用研究

史俊岩  
【摘要】: 目的 肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS)是由布尼亚病毒科汉坦病毒属病毒引起的自然疫源性传染病。HFRS在我国的发病率占全球总数的90%,病死率为3%~10%,是我国重点防治的传染病之一。由于HFRS临床表现复杂多样,病情变化迅速,常给临床诊断带来一定困难。目前,血清学检测方法仍然是HFRS实验室诊断的主要方法,但是建立在抗原抗体反应基础上的血清学检测方法的敏感性达不到临床诊断的要求,常造成漏诊和误诊,病人往往因得不到及时诊断而延误治疗。因此,建立高敏感性和高特异性的HFRS实验室诊断技术对于HFRS的辅助诊断具有重要意义。 本实验借鉴免疫-PCR技术高敏感性的特点,将其应用于HFRS的辅助诊断,进行以下研究:(1)将汉坦病毒HTN型标准株76-118株核衣壳蛋白(nucleocapsid protein, NP)基因克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中,构建重组表达载体pGEX-6P-1-hanS,并在大肠杆菌中进行有效的表达,以期获得具有生物学活性的重组蛋白,为汉坦病毒的临床诊断和流行病学调查研究提供一种廉价、安全、可靠的免疫诊断抗原。(2)以HFRS患者血清中抗HFRS-IgG抗体作为待测抗体,重组NP作为诊断抗原,创建可用于检测抗HFRS-IgG抗体的免疫-PCR检测方法,并与传统的ELISA方法进行比较,以期阐明免疫-PCR方法用于HFRS诊断的可行性及优越性。(3)应用免疫-PCR方法检测HFRS不同病程患者血清中抗HFRS-IgM抗体,期望建立一种适合于基层医疗单位通用的HFRS早期诊断方法。 方法 1.原核表达载体pGEX-6P-1-hanS的构建 以质粒pAC一hans为模板,按常规PCR方法扩增汉滩病毒76一118株S 基因全长编码区片段。S基因片段与质粒pGEX石P一1进行双酶切,酶切产 物混合后加人等体积的DNA连接缓冲液,16℃水浴孵育45而n。将连接后 重组子按常规方法转化感受态宿主菌E.cohBL一1(DE3),经药物平板筛选 阳性菌落,利用酶切和PCR扩增鉴定重组质粒。 2.重组蛋白的表达及纯化 将原核表达载体pGEX石P一l一hans转化E.eoliBL一l(DE3),从平板上随 机挑选单菌落,接种于含氨节青霉素(50m岁妞)的SlnlLB液体培养基中, 37℃振荡培养过夜。次日取过夜培养物IPTG诱导培养,离心收集菌体进行 超声破碎,超声破碎后产物离心,留取上清进行亲和层析纯化。纯化后产物 按常规方法进行SDS一PAGE电泳及Westem一Blot分析。 3.间接EUSA方法检测抗HF’RS一I步抗体 以纯化的HTN病毒重组NP为抗原包被聚苯乙烯微滴度板,封闭液封 闭。加1:10稀释待测患者血清,37℃孵育30而n。然后依次加人辣根过氧 化物酶标记羊抗人I多,底物缓冲液,ZMHZSO;终止反应,于BIO一RAD550 酶标仪上读取OD400光密度值。结果判定以待测血清和阴性血清OD400光密 度值的比值)2.1为阳性判断标准。 4.间接免疫荧光法检测抗HFRS一IgG抗体 将待测患者血清l:10稀释混匀后,取100闪滴加到抗HFRS一I多抗原 片上,37℃孵育30而n;用0.IMPBS冲洗后加荧光标记的羊抗人I步,37℃ 孵育30min,冲洗后吹干;荧光显微镜下观察结果,结果判定以黑色背景中 出现绿色荧光者为阳性。 5.普通免疫一PCR法检测抗HFRS一I步抗体 以纯化的HTN病毒重组NP为抗原包被聚苯乙烯微滴度板,加120泌 封闭液封闭。加人1:10稀释待测患者血清,然后依次加人100闪生物素标 记羊抗人I步、50闪链霉亲和素、50泌生物素标记DNA。洗涤液充分洗涤 后向每孔内加人50川去离子水,94℃预变性6min,收集上清液。‘取5闪上 清液作为模板,移人0.sm1PCR管中进行PCR扩增。扩增产物1%琼脂糖 凝胶电泳,EB染色,于GDS800O紫外凝胶自动成像系统照相,分析结果。 6.戊二醛处理后的PCR管包被 取洁净的0.5祖规格的PCR管若干,每管加人不同浓度(0.1%、0.2 %、0.8%、2.0%)稀释的戊二醛溶液50闪,37℃孵育3一5h。双蒸水洗净 后,以纯化的HTN病毒重组NP为抗原包被PCR管,加120闪封闭液37℃ 封闭lh。4℃保存。 7.紫外线照射后的PCR管包被 取洁净0.5血规格的PCR管若干,口向上置于超净工作台内,分别于 不同时间内(0.sh、lh、3h、sh)进行紫外线照射,然后以纯化的HTN病毒重 组NP为抗原包被PCR管,加120闪封闭液37℃封闭lh。4℃保存。 8.改良免疫一PCR方法 以纯化的11TN病毒重组NP为抗原包被经戊二醛处理的0.sdPCR 管,加120闪封闭液封闭。加人1:10稀释待测患者血清100闪。然后依次 加人100闪生物素标记羊抗人IgG(IgM)、50闪链霉亲和素和50衅生物素 标记DNA,双蒸水洗涤后直接进行PCR扩增。扩增产物1%琼脂糖凝胶电 泳,EB染色,于GDss000紫外凝胶自动成像系统照相,分析结果。 9.酶免测定抗HFRS一IgM抗体 待测血清1:10稀释后加人已封闭好的微滴度板中,37℃孵育30niln。 然后依次加人辣根过氧化物酶标记羊抗人IgM,显色液,终止反应后,于 Blo一RAD550酶标仪上读取0D450光密度值。结果判定以待测血清OD45。光 密度值续临界值时为阳性。 10.统计学分析方法 采用xZ检验决定统计学的显著性差异,P0 .05具有意
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R512.8

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