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《中国医科大学》 2004年
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微透析方法检测万古霉素在玻璃体内代谢的实验研究

王亚玲  
【摘要】: 前言 细菌性眼内炎是一种严重的眼部感染性致盲性疾病,是内眼手术和眼外伤最常见的并发症之一;眼内炎的致病菌有许多种,其中以革兰氏阳性球菌最常见。万古霉素,一种对革兰氏阳性球菌敏感的抗生素,已成为治疗眼内炎的首选药物。 临床上为了有效地治疗这种疾病,需要相关抗生素精确的药代动力学资料。尽管研究眼内药代动力学的方法有许多种,但是各有其缺陷。本文采用的微透析方法,作为一种标准的采样方法在神经化学界已经得到广泛的认可;在眼科领域,国外学者也已成功地应用于玻璃体和房水的采样。 为了动态观察万古霉素在玻璃体内的分布和消除,我们设计一种微透析探针,植入兔眼玻璃体内,可以连续检测清醒兔玻璃体内万古霉素的浓度变化,并与传统的直接采样方法进行了比较。 实验材料 一、动物 健康成年白化兔36只,雌雄不限。 二、试剂 万古霉素为层析纯化药品,磷酸二氢钾为分析纯,乙腈为色谱纯;Ringer's液为平衡盐液,其余试剂均为分析纯。 实验方法 一、实验组(微透析组) 1.眼内炎模型的制备:将2000cfu/0.1ml的金黄色葡萄球菌悬浮液,接种于兔眼玻璃体腔内,于72小时后,模型成功。 2.探针的制作:微透析系统由微透析探头、连接管、收集管、灌注液和微量灌注泵组成。 3.微透析探针的植入:角巩膜缘后做4×3mm的巩膜瓣,在瓣下角巩 膜缘后2一~处打一孔,将探头插人玻璃体腔内,探针的人口管和出口管 固定于巩膜壁、眶骨及皮肤上。 4.回收率的测定:配制20u扩时标准万古霉素溶液,持续灌注探针,每 20min采样一次,3次,检测色谱峰,利用峰面积,计算回收率。 5.微透析采样(清醒兔模型的制备):探针植人后24h,兔清醒状态下, 将lm酬0.1血的万古霉素溶液注射于正常兔眼和眼内炎兔眼玻璃体内,立 即用凡nger’s液持续灌注,每20min采样一次,持续6h,然后分别在12h、 24h、48h、72h和84h采样4oul,HpLC一UV检测万古霉素的浓度。 二、对照组(直接采样组) 将lmg/0.1而的万古霉素溶液注射于正常兔眼玻璃体内,分别在1、 12、24、48、72和84h处死兔4只,摘除眼球,抽取全部玻璃体,经过滤提纯 后,HPLC一UV检测。 三、药物分析方法:高效液相色谱法(HPLC一UV) 色谱条件:色谱柱:K士omasU C18(250 x 4.6~);流动相:乙睛:0.05M KHZpO4(10:90),pH=4.0;流速:1·0IllF而n;HpLC一UV检测波长:210nm; 进样量:20d;灵敏度:0.01u岁血;柱温:室温23”C;检测限度:0.05u扩nil。 按倍比稀释精确配制一系列浓度的标准万古霉素溶液,HPLC一Uv检 测,绘制标准曲线和方程;然后根据标准方程和探针的回收率,计算玻璃体 内万古霉素的实际浓度。利用t一test检验,进行统计学分析。 四、数据处理:本文数据采用3 p97药代动力学软件进行统计学处理。 实验结果 一、万古霉素的标准曲线和方程,方程为y二353531x一127369,R= 0 .9999。 二、在整个实验过程中,所有兔眼对探针的相容性良好,没有感染、白内 障和视网膜脱离等并发症的发生。探针的回收率为8一12%。 三、实验组正常兔眼玻璃体内万古霉素的最大浓度为715.29u扩血,半 衰期为51 .66h,清除速率常数为0.026u扩h;炎症兔眼玻璃体内万古霉素的 最大浓度为609 .22u岁耐,半衰期为11 .91h,清除速率常数为0.O95u扩h。 所有的动物在注药后30石Omin,万古霉素在玻璃体内达到最大浓度,炎症 眼玻璃体内万古霉素的代谢明显快于正常眼。两组数值t一检验,有显著统 计学意义,p0·01。 对照组正常兔眼玻璃体内万古霉素的最大浓度721 .45u岁耐,半衰期 为43 .28h,清除速率常数为0.022u扩h,直接采样方法检测的正常兔眼玻 璃内万古霉素的浓度高于微透析组,由此导致曲线下的面积高于微透析组, 清除速率常数基本一致。注药后84h内,所有动物玻璃体内万古霉素的浓 度均高于最小抑菌浓度。两组数值t一检验,有显著统计学意义,p0 .05。 讨论 本实验采用自制的微透析探针建立了从实验动物的手术、眼内微透析 到高灵敏度检测的一整套实验方法,初步观察了兔眼玻璃体内注射万古霉 素后,其在正常兔眼和眼内炎兔眼玻璃体内的浓度变化,并与传统的采样方 法进行了比较。 微透析技术起源于脑内神经递质的研究,在神经化学界得到广泛的认 可,并用于体内许多组织和器官;在眼科领域,国外学者利用此方法已成功 地进行玻璃体和房水的采样。微透析方法特别适合于象眼球这样体积小、 结构紧密、由各种屏障包绕的器官。 本实验采用清醒的实验动物模型,消除或减少了麻醉和探针植人的手 术创伤对万古霉素代谢的影响,是最适合临床前期研究的实验模型。 万古霉素对不同的致病菌有不同的最小抑菌浓度,对革兰氏阳性球菌 的最小抑菌浓度为su群耐,但通常认为治疗水平为10一ou扩血。本实验 中,实验组所有动物在注药后30石O而n达到最大浓度;万古霉素在正常兔 眼内的半衰期明显大于炎症眼,说明了病理状态下,万古霉素的代谢发生了 明显
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R96

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