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《中国医科大学》 2004年
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维持性血液透析患者淋巴细胞DNA的氧化损伤及透析膜、维生素C对其影响

赵勤  
【摘要】: 前言 慢性肾功能衰竭(Chronic Renal Failure,CRF)患者体内的氧化应激反应是增强的。血液透析(Hemodialysis,HD)治疗可以激活体内的补体系统,刺激中性粒细胞以及单核细胞的氧代谢,产生大量的活性氧族(Reactive Oxygen Species,ROS),使得CRF患者体内的氧化应激反应进一步增强。与此同时HD治疗还导致一些抗氧化物质的损失,如维生素C、E、谷胱甘肽等,导致HD患者体内ROS的产生和抗氧化系统之间失平衡。维持性血液透析(Maintenance Hemodialysis,MHD)患者在接受HD治疗,尤其是使用生物相容性差的透析膜时,血-膜接触使得ROS的产生增多。ROS主要与DNA中的核糖反应,夺取其C-4位上的H原子,导致DNA结构不稳定,发生断裂。目前检测DNA链的断裂的主要方法是单细胞凝胶电泳实验,即彗星实验(Comet实验)。本实验将通过Comet实验来了解MHD患者淋巴细胞的DNA损伤程度,同时观察不同种类的透析膜及维生素C对MHD患者DNA的氧化损伤程度是否有影响。 实验材料与方法 一、实验材料 淋巴细胞分离液、1%普通熔点琼脂糖、1%低熔点琼脂糖;恒温水浴箱、离心机、培养箱、电泳仪、荧光显微镜。 二、实验方法 1、研究对象:选择我院血液净化中心接受MHD治疗6个月以上、临床情况稳定、年龄大于20岁的CRF患者20例,随机分成2组,每组10例。1组为HE组,使用血仿膜透析12周;2组为PS组,使用聚砜膜透析12周。同时选择7例在年龄、性别与患者组相匹配的健康人作为正常对照组。 2、检测方法: ①、分离淋巴细胞:取抗凝全血50ul置于锥底离心管中,1ml室温1640稀释,加入淋巴细胞分层液,4℃,4500r/分钟离心3分钟后获得淋巴细胞。 ②、孵育:将获得的淋巴细胞悬液分为2组,1组加人1血1640;1组加 人1耐10u岁血维生素C,37℃,孵育1小时。 ③、COMET实验:将细胞悬液离心后加人低融点琼脂糖制备成细胞悬 液备检。载玻片上分别均匀的铺一层普通熔点琼脂糖、细胞悬液、低融点琼 脂糖。待琼脂糖凝固后,将载玻片浸人4℃裂解液中裂解、解旋、电泳、中 和、染色后,于荧光显微镜下观察结果,并摄影、记数彗星率及彗星尾部长 度。 ④、结果观察:每个观察对象同时做2张片子,每张片子记数50个细 胞,测量彗星整体长度及头部直径,计算后得出彗星尾部长度,作为DNA氧 化损伤程度的观察指标。 三、统计分析:实验数据采用SPSS n .5统计软件进行描述性及相关分 析,组间比较采用单因素方差分析,维生素C处理前后使用独立样本t检 验,数据以又土S表示,以P0 .05为有统计学意义。 结果 1、各组彗星尾长的测量值:MHD患者的彗星尾长和彗星率均显著高于 正常对照组(HE组彗星尾长:0.970士0.120um,彗星率14.8%;PS组彗星 尾长0.656土0.187um,彗星率11.5%;对照组彗星尾长0.286士0.194um, 彗星率5.3%;P0.05)。维生素C处理前HE组彗星尾长及彗星率均显 著地高于PS组(P0.05)。维生素C处理后HE组彗星尾长为0.788土0. 26Otnn,彗星率为13.5%;PS组彗星尾长为0.670*0.295uln,彗星率为11. 6%。两组维生素C处理前后彗星尾长和彗星率没有显著统计学差异。 2、DNA氧化损伤与血清肌醉、尿素氮的相关性:DNA损伤程度与患者 的血清肌醉、尿素氮浓度呈显著的正相关(P宾0.001)。 3、DNA氧化损伤与其他因素的相关性:未发现年龄及透析龄与DNA 的氧化损伤之间存在显著相关性。 讨论 MHD患者体内氧化应激反应增强可能与以下三个因素作用有关:尿毒 症本身状态、透析膜的生物相容性和透析液的病原微生物污染。尿毒症患 者DNA氧化损伤增强是肾功能衰竭、毒素蓄积的结果。而患者接受血液透 析治疗时,血一膜的接触,在患者体内ROS的产生中起着重要的作用。当 使用生物相容性差的透析膜(如纤维素膜)进行透析治疗时,ROS的产生将 会增多。ROS主要与DNA中的核糖反应,除去C一4位上的H原子,导致 DNA结构不稳定,发生断裂。此外,血液透析所使用的透析液内通常不同 程度的存在内毒素含量,它可刺激巨噬细胞、中性粒细胞的氧代谢,产生 ROS。Comet实验作为研究DNA双链结构改变的实验方法,因其灵敏性和 可靠性得到了广泛的应用。本实验即是使用此方法来检测MHD患者淋巴 细胞的DNA损伤情况。 ”本实验结果发现,MHD患者的DNA损伤程度显著地高于正常对照组, 。NA损伤程度与患者的血清肌配、尿素氮浓度呈显著的正相关,这说明 MHD患者DNA氧化损伤增强是肾功能衰竭、毒素蓄积的结果。但未能发 现年龄及透析龄与DNA的氧化损伤之间存在显著相关性,这可能与本实验 的样本量较小,受试对象的平均年龄及透析龄相对较短有关。本实验结果 还发现使用血仿膜透析的患者的淋巴细胞的DNA损伤程度重于使用聚矾 膜透析的患者,由此可见透析膜生物相容性的优劣对DNA氧化损伤的影响 是不可忽视的。 本实验同时观察了维生素C对DNA氧化损伤的修复作用,从而研究 其抗氧化的机制。我们的结果未能发现维生素C对MHD患者淋巴细胞的 DNA损伤有显著的改善作用。但是在HE组,我们发现使用维生素C处理
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R692.5

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