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《中国医科大学》 2004年
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诱导大鼠骨髓间充质干细胞向胰岛样细胞分化

夏鲲  
【摘要】: 目的 近几年,糖尿病发病率不断上升。据调查目前全世界的糖尿病患者数已超过1.51亿。临床上通常采用皮下注射胰岛素来治疗Ⅰ型和部分Ⅱ型糖尿病病人,但治疗效果不理想,且很难阻止糖尿病并发症的发生及发展。植入胰岛β细胞或其替代物是一种治疗糖尿病的新方法,但供者细胞来源不足及免疫排斥反应等限制其广泛应用。干细胞作为一类具有多向分化潜能的细胞,已经逐渐成为人们寻找胰岛β细胞替代物的新资源。 成体干细胞具有跨系分化的能力,如肝干细胞可以分化为胰腺β细胞,神经干细胞能够分化为血细胞等。骨髓间充质干细胞是一类具有向多种细胞分化潜能的细胞,是一种理想的组织工程种子细胞,易于提取,分离及扩增,在特定的条件下,可以分化为骨软骨,肌肉等中胚层组织细胞,还可以跨胚层分化为神经细胞等。 发育过程中的神经元和胰岛细胞的表型有许多相似之处,已从胰岛分离培养了nestin阳性的细胞,具有分化为β细胞的潜能,这些迹象均表明nestin阳性的细胞和胰岛细胞之间可能存在密切的关系。而最近的研究表明在体外很容易通过改变培养微环境从骨髓间充质干细胞获得nestin阳性的细胞,已有研究证实MSC移植入糖尿病大鼠体内,在胰腺发现了移植的MSC,但这些细胞是否能够分化成胰岛样细胞,是否能够分泌胰岛素尚有争议。因此,我们用共培养的方法在体外诱导大鼠间充质干细胞向类胰岛样组织分化,进一步探索应用骨髓间充质干细胞体外诱导分化获得产生胰岛素的细胞的可行性,为糖尿病治疗提供理论依据。 方法 1、大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)的分离培养和鉴定 1.1 无菌条件下取大鼠股骨骨髓细胞离心做原代培养 1.2 传代培养根据细胞的贴壁性能不同选取贴壁不牢的细胞继续培 养。 1.3免疫细胞化学方法鉴定CD45,CD90的表达情况。 2、大鼠胰腺细胞的分离培养和鉴定 2.1无菌条件下取大鼠胰腺细胞离心做原代培养 2.ZD咒染色法鉴定培养的胰腺细胞 3、大鼠胰腺细胞与MSC共培养诱导MSC向胰岛样细胞分化 3.1交通分隔培养的方法把胰腺细胞和MSC共培养。 4、诱导后胰岛样细胞的鉴定 4.1诱导后细胞形态观察。 4.2 DTz染色鉴定胰岛细胞。 4.3 RT一PCR方法鉴定insulin的表达。 4.4免疫细胞化学方法鉴定ins己in的表达。 4.5免疫荧光方法鉴定ins山n的表达。 结果 l、分离培养鉴定了大鼠骨髓间充质干细胞,免疫组化CD45(一)CDgC) (+)细胞的纯化均一程度达到80%。 2、bFGF预诱导MSC获得nestin阳性细胞。 3、分离培养了大鼠的胰腺细胞,D咒染色大部分细胞成猩红色,表明获 得胰岛含量相对较高的细胞。 4、共培养法诱导MSC分化为可分泌胰岛素的细胞。诱导后的细胞形 态由原来的梭形逐渐变为圆形,并且少数成聚集细胞团,呈半悬浮状态, DTZ染色呈现特异的猩红色,RT一PCR检测到PDX一l,insulin的表达,免疫细 胞化学,免疫荧光染色可见表达ins以in的阳性细胞。 结论 推测采用体外细胞共培养的方法有可能将间充质干细胞诱导分化成可 以表达胰岛素的细胞。
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R329.2

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