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抗NI-35重组单链抗体表达载体的构建与融合表达

孙涛  
【摘要】: 目的 抗NI-35抗体(anti-NI-35 antibody)作为神经再生抑制因子(NI-35)的拮抗剂对神经再生促进作用的研究是近年的热点。由Bendey等所进行的一写实验证实了中枢神经系统神经元缺乏再生能力并非其内在特性,而是由于中枢神经系统髓鞘质本身,少突胶质细胞等强烈抑制轴突的生长,这一特性与分子量为35000dal(NI-35)及分子量为25000dal(NI-250)的髓鞘质蛋白相关。 研究表明,抗NI-35抗体能促进体内外受损伤神经元的存活和突起生长。Schnell等应用单抗抗NI-35抗体中和NI-35的抑制作用,完全切断皮质脊髓束后,于2-3周内使断裂轴突再生7-11mm,证实中和髓质相关生长抑制因子可使轴突于分化的中枢神经系统中再生并延伸,Schwab等证明应用这种抗体在脊髓半切损伤模型中,未损伤侧皮质脊髓束可发出侧芽到损伤侧,并有部分功能恢复。Cadelli.D的研究证明抗NI-35抗体应用于损伤的大鼠脑脊髓神经轴突可显著增强其的损伤后再生。这些研究,为临床治疗DAI提供了实验基础和理论依据。 近年来,抗体治疗应用已成为抗体研究的热点,目前经美国FDA批准进入临床观察的抗体及抗体片断已达近百种。但随着研究的深入,鼠源性抗体暴露了其固有的缺陷,由于相对于人体为外源性物质,因此,多次给药可促进体内免疫球蛋白的亲和性成熟,产生人抗体,引发过敏反应。其次,完整抗体的分子量可达155KD,在血脑屏障的作用下,如此大的分子量很难通过毛细血管进入损伤部位。此外,完整抗体由可变区和恒定区构成,其恒定区即Fc段,除能引起免疫反应外,还可与存在与正常组织的Fc受体结合,改变抗体在体内的分布,完整抗体的这些结构缺陷限制了他的临床应用。 据此,我们重新设计并人工合成抗NI-35重组单链抗体(anti-NI-35-scfv)的cDNA克隆,构建其表达载体,在原核系统中实现初步表达。它由抗体分子中构成抗原结合部位的重链可变区和轻链可变区借助一连接短肽 连接而成,由于只保留了V区,免疫源性大大降低,同时由于没有F。段,不 能与非靶细胞的Fc受体结合,更利于集中到到损伤部位。此外,分子小是 单链抗体的一大优势,目前认为,scFv是能够保持与抗原有效结合的最小 单位。完整抗体在构建为单链抗体以后,其分子量通常只为原有分子的1/ 5或1/6,较小的分子量使其在体内的分布指数较完整抗体有明显升高,更 有利于临床应用。 方法 1.根据genebank中发表的anti一M一5抗体的轻链重链序列,重新设计 适于在大肠杆菌中表达的基因片段。将该基因双链分35个小片段合成,经 退火、复性连接成目的片段后,克隆到克隆载体pUC一18中,经全自动序列 分析仪测序证实后,再亚克隆至表达载体pET一8a(+),转化大肠杆菌 BL21,诱导表达。 2.以IPrG诱导含有重组表达质粒pET一8a(+)/744的E.coli BL21 (DE3),进行sDs一PAGE分析,用密度扫描仪确定目标蛋白占菌体蛋白的百 分比。 3.按Ni一NTA resin金属亲和层析试剂盒操作程序进行融合蛋白的纯 化。SDS一PAGE及凝胶灰度扫描测定蛋白纯度,Bradfo记法测定蛋白浓度。 4.调整蛋白浓度至loou岁而(加人6M PH 8.0 urea).加人4倍体积复 性液,(20rrirnol/L Tris,250nunol/L NaCI,0.5%PMSF,ZmmoFL还原型谷胧 甘肤,02mmoFL氧化型谷胧甘肤,100~OFL EDTA)4摄氏度复性24小 时,让后将复性样品转移至截流分子量为8一roKD的透析袋中用透析液 (20~。FLTri,,500~OFL Nacl,10%甘油)透析48小时,中间更换新鲜透 析液一次,透析后样品经l(XX刃g离心20分钟。将离心后得到的蛋白样品- 20摄氏度保存。Bradford法测定蛋白浓度。 结果 1.测序结果是合成的基因序列与设计的仅差一个碱基重组子pUC18/ 测序结果示:第429位碱基发生突变(C*T),但并未造成编码氨基酸改 2.SDS一PAGE检测显示,表达出相对分子量31kD的融合蛋白,并得到 了良好的生物活性。该蛋白全长278个氨基酸,推测分子量为31kp,SDS- 以GE分析表明,表达的蛋白大小与预期的相符合,在IPTG的诱导下,表达 量随时间的增加而增加,至4小时后达到诱导高峰。密度扫描揭示约占细 菌蛋白的11%。 3.借助能与His一tag序列特异性结合的Ni一NTA亲和层析柱对变性蛋白 进行纯化,得到了高纯度scFv蛋白,凝胶灰度扫描显示蛋白纯度高达 86%,Bradford检测显示蛋白浓度达1 .Zmg/mL。复性后的蛋白溶液澄清, 且凝胶电泳呈单一条带,提示经复性处理后,anti一M一5一scFv获得正确构 象,且保持有效浓度。 结论 我们成功合成了anti一M一5抗体的轻链可变区与重链可变区cDNA序 列,并通过中间接头(Gl抖Ser)3将二者连接起来,重新构建了anti一M一5的 重组单链抗体cDNA全基因,并克隆至载体pUC18中,测序正确。采用含 有6xHis一tag的融合蛋白表达系统。将构建好的scFv基因经常规转化和筛 选克隆至PET一8a(+)表达载体,并由IPTG诱导在E.coh BUI中表达an- ti一M一35一scFv蛋白。表达产物长278个氨基酸,分子量约为31 .okD,以包涵 体形式存在,同时本实验利用镍一次氨基三乙酸(Ni一NTA resin)金属亲和层 析基质对6xhis一tag的


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