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《中国医科大学》 2004年
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5-HT诱导肺动脉平滑肌细胞增殖及其与MAPKs信号转导通路的关系

宋丹  
【摘要】: 前言 肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension,PAH)是临床常见疾病。大量研究表明:肺血管收缩反应增强和肺血管重构(remodeling)是PAH形成的主要血管变化,人们发现血管重构是肺动脉压持续升高的主要因素,而肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells,PASMC)增殖则是血管重构的中心环节。近年来5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)在PAH形成和发展中的作用受到人们的重视。研究表明,它诱导PASMC的增殖与其特异性转载体介导的内在化有关。而且这一作用可被5-HT转载体(5-HT transporter,5-HTT)选择性抑制剂帕罗西汀、氟西汀剂量依赖性抑制。ERK/MAPK(extracellular signal-regulated protein kinase/mitogen-activated protein kinase,ERK/MAPK)信号转导通路与细胞生长分化密切相关,同时在其它类型的血管平滑肌细胞中5-HT诱导的增殖效应与MAPK信号转导通路的关系曾有过报道,但在PASMC中MAPK通路是否参与5-HT的信号转导尚未见报道。但有研究表明,在完整的细胞中,5-HTT介导的5-HT诱导的PASMC增殖与MAPK信号转导通路的激活有关。 为此本实验应用5-HTT选择性抑制剂氟西汀,以明确5-HTT在5-HT促进PASMC增殖过程的作用。并假设5-HTT所介导的PASMC增殖是通过ERK1/2 MAPKs信号转导通路实现的。首次应用针对ERK1/2 MAPK的反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,ASODN)抑制PASMC中ERK1/2的表达,使ERK1/2含量下调,观察其对PASMC的增殖情况及细胞周期的影响,以明确5-HTT介导的PASMC增殖与ERK1/2 MAPKs信号转导通路的关系。 方法 采用贴块法分离培养大鼠肺动脉平滑肌细胞。首先应用不同浓度的5-HTT抑制剂氟西汀(10~(-5)M-10~(-7)M)预作用细胞,进行MTT和流式细胞 仪检测观察其对5一HT诱导的PASMC增殖情况及细胞周期的影响。应用 脂质体介导ERKI/2 ASODN、正义ODN和随机ODN的细胞内转染,同样应 用M竹和流式细胞仪方法进行检测,以观察不同类型ODN对5一HT诱导 的PASMC增殖情况及细胞周期的影响。实验数据以Mean士SD表示,组间 对比采用t检验,P0.05认为差异显著,P0.01认为差异非常显著。 实验结果 1.氟西汀对5一HT诱导PASMC增殖的作用: 5一HT(20一6皿)显著促进玖sMe增殖。氟西汀(20一,一ro一’M)对5- HT诱导的PASMC增殖有抑制作用,且呈剂量依赖关系,10一SM浓度时抑制 作用最强,而在10一7M浓度时则无抑制作用。因此选择10一6M为下一步实 验中氟西汀的浓度。10一SM和10一6M浓度的氟西汀与5%FBs组间的细胞 存活率无明显差异,说明氟西汀对血清诱导的细胞增殖无抑制作用。 2.ODN对5一HT诱导PASMC增殖的作用: 反义ODN可显著抑制5一HT诱导的PASMC增殖,正义和随机ODN 对5一HT诱导的平滑肌细胞增殖无抑制作用。应用反义ODN组与5%FBS 组间的细胞存活率存在显著差异。说明ASODN不仅能抑制5一HT诱导的 细胞增殖作用,对血清诱导的细胞增殖也有抑制作用。 3.流式细胞仪细胞周期分析: 5一盯(10一6M)组中以sMe的sPF及H值较5%FBs组增加,而应用 氟西汀(10一6M)预作用细胞可使两个指标较5一HT(10一6M)组下降。 ASODN也可降低5一HT诱导的PASMC的SPF及PI值增加,且其下降幅度 较氟西汀组要大。 讨论 本实验应用5,HTT选择性抑制剂氟西汀预作用PASMC,可明显抑制 5一HT的促细胞增殖效应。进一步证明了5一HTT在5一HT诱导PASMC 增殖中的介导作用,也为研究5一H’I’细胞内信号转导提供了方向。同时, 本实验首次通过ERKI/2 ASODN转染PASMC,有效地抑制了5一HT诱导 的细胞增殖效应,表明ERKI/2 MAPK信号转导通路参与在以SMC中5- HT的信号转导。 近来的研究表明5一HT对PASMC的促增殖作用与低氧条件下细胞中 5一H,I’r表达增加有关。而且,应用5一H竹选择性抑制剂及5一H竹基因 敲除等方法可抑制低氧诱导的以H,证明5一HTT在PAH形成和发展中起 到重要作用。本实验在细胞水平上,应用5一HTT选择性抑制剂氟西汀抑 制PASMC在5一HT作用下的增殖反应,再一次证实了5一HTT的介导作 用。有助于明确PAH的病理机制,同时也为PAH的治疗提供了新的靶点, 应用5一H,IT抑制剂抑制血管平滑肌细胞增殖,可防止肺血管重构的发生。 本实验成功应用脂质体介导ERKI/2 ASODN转染PASMC。并观察到 ERKI/2 ASODN能够显著抑制5一HT促细胞增殖,直接证实了ERKI/2 MAPK信号转导通路参与5一HT在PASMC的信号转导。研究表明5一HT 诱导的PASMC增殖过程中5一HTI’所介导的信号转导通路可能为:GAP酪 氨酸磷酸化、RAS激活*NAD(P)H氧化酶激活产生ROS、激活·ERKI/2 MAPK。因此应用5一HTT选择性抑制剂即可抑制5一HT诱导的ERKI/2 MAPK信号转导通路的激活。 本实验的结果提示,5一HTT介导的5一HT内在化是PASMC发生增殖 的重要机制,与PAH时肺血管重构关系密切,是PAH重要发病机制之一。 同时,ASODN的应用也为PAH治疗提供了一个新的方案。 结论 1.5一HTr选择性抑制剂氟西汀可抑制5一HT诱导的PASMC的增殖, 明确了在PASMC中是5一HTr介导5一H
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R543

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