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《中国医科大学》 2004年
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雄性小鼠生殖细胞Cdc2与P~(70)S6K相关性研究

宋宇彤  
【摘要】: 前言 哺乳动物细胞的繁殖与生长是一个被精细调节的过程。在细胞生长的过程中80%的能量将会消耗在细胞核糖体的生物合成上;为了繁殖的继续进行,遗传物质必须被平均分配到两个子细胞中,此时细胞大部分的能量被用在遗传物质的保护和分离上,合成代谢的水平很低。虽然分裂过程中细胞合成代谢相对被抑制的机制还没有得到阐明,但目前研究认为Cdc2和P~(70)S6K参与了这个精密的过程。 MPF(M phase Promoting Factor)是细胞分裂的中心调控因子,由催化亚基Cdc2和调节亚基周期素B(cyclin B)组成,其中Cdc2是MPF的活性单位,具有丝/苏氨酸蛋白激酶活性。作为cyclin依赖激酶,Cdc2的激酶活性在很大程度上抑制了细胞的合成代谢,使细胞的蛋白合成进入了一个相对的静止期,而细胞主要的能量则被应用于细胞分裂时的染色体的浓缩、核膜的降解、纺锤体的形成等。Cdc2的活性调节机制有两种,一是与受cyclin B结合的情况;其次就是它自身多种氨基酸残基的磷酸化状态,其中当Tyr15处于磷酸化状态时,MPF无活性,从而抑制G2/M的转换。最新研究表明P~(70)S6K也是Cdc2的直接底物之一,Cdc2可以通过P~(70)S6K调节具有5′TOP的mRNAs的翻译。 关于P~(70)S6K的研究主要集中在细胞生长的调控方面,很多年来真核生物核糖体40S亚基上的核糖体S6蛋白质被认为是P~(70)S6K的唯一底物,P~(70)S6K是一种信号传导的末梢激酶。目前认为P~(70)S6K是通过磷酸化核糖体S6蛋白质调节具有5′TOP的mRNAs(oligopyrimidine tract at their 5′ transcriptional start site)的翻译来调控细胞生长。Cdc2在细胞分裂的过程中可以通过抑制P~(70)S6K来减弱具有5′TOP的mRNAs的翻译,进而抑制合成代谢。 在有关细胞有丝分裂的报道中,Cdc2通过抑制P~(70)S6K来调节细胞的繁殖与生长,但在生殖细胞发育减数分裂过程中,关于Cdc2与P~(70)S6K的生理作用和相互关系还尚未明确。为此我们研究了雄性小鼠在不同发育阶段的睾丸组织及生殖细胞中Cdc2与P~(70)S6K蛋白表达及活性变化,揭示了 CdcZ与P70S6K在生殖细胞减数分裂的调控作用及相关性。 实验材料与方法 实验材料 1实验动物雄性昆明系小鼠由中国医科大学实验动物部提供 1.2 Western Blot相关试剂 1.3组合酶 1 .4酶活性检测相关试剂 1 .5免疫组化相关试剂 2.实验方法 2.1应用朱培元等和Bellve等方法分离小鼠翠丸组织生殖细胞的并 作改良。 2.2应用免疫组化方法检测CdcZ肠rls的磷酸化状态,CdcZ表达情 况及P70 S6K的细胞分布。 2.3应用westem Blot方法检测上述组织中CdcZ与P70S6K蛋白表 达情况。 2.4应用Kinas。Assay方法检测小鼠翠丸组织生殖细胞护“S6K的活 J胜。 实验结果 1 .CdcZ在精原细胞、初级精母细胞及精子细胞中的胞浆与胞核中均有 表达,精子中也有所表达,但相对淡染.。 2.cdcZ介rls的磷酸化情况在10天龄的小鼠攀丸组织中无着色,随着 鼠龄增加,生殖细胞染色明显增强。 3.P70S6K主要在精母细胞、精子细胞及精子中有所表达,在不同发育 阶段细胞内的分布不同。 4.westem印迹中Pvos6K在不同天龄翠丸组织的细胞中表达变化不明 显。 5.Kinas。Assay显示随着小鼠天龄的增加,护“s6K的活性逐渐上升。 讨论 一、生精过程中CdcZ的蛋白和活性变化 CdcZ在10天龄初级精母细胞中已经开始表达,但表达量并不多,由于 此时小鼠翠丸组织还没有下降到阴囊,生殖细胞无法正常分裂;而在20天 龄小鼠初级精母细胞中开始观察到CdcZ的表达,这是为了满足生殖细胞减 数分裂的需要。值得注意的是我们在精子中同样观察到CdcZ的表达,只是 相对淡染,这说明在不再进行减数分裂的成熟生殖细胞中CdcZ没有完全消 失。对CdcZ的场巧的磷酸化状态进行检测的结果发现,在性成熟模型 中,T刁15的磷酸化水平随着天龄的增加不断加强,在精子出现的时候CdcZ 场巧就已经被磷酸化。CdcZ场巧的磷酸化抑制CdcZ的活性,它的磷酸 化可以导致MPF复合物解离,使其失去生物活性,综合以上实验结果可以 说明:在雄性小鼠生殖细胞发育过程中,CdcZ在精原细胞、初级精母细胞及 精子细胞中表达,随着翠丸组织中生殖细胞的不断成熟,生殖细胞中CdcZ 活性逐渐下降;CdcZ在精子中同样存在,但已失去其生物活性。这正是因 为在原始生殖细胞定向发育过程中需要MPF的活性以完成其两次减数分 裂;一旦生殖细胞分化为比较成熟的精子细胞和精子,细胞已经没有进行高 速分裂的需要,此时CdcZ场巧的磷酸化程度增强,使MPF的催化亚基 cdc2.与调节亚基cychnB解离,从而使MPF开始失活,成熟生殖细胞的产 生速率被维持在一定水平,使细胞进人一个稳定的繁殖期。 二、生精过程中P70 S6K的位置和活性变化 在雄性生殖细胞系中,关于护“S6K对细胞生长繁殖及分化的研究还是 一片空白,免疫组化方法检测结果发现:在初级精母细胞中护”S6K有明显 表达,但胞核的着色明显深于胞浆,而在精子中则无此趋势,这说明在生精 过程中,护“S6K可能从胞核转移到胞
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:Q492

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