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《中国医科大学》 2007年
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精氨酸脱酰酶的克隆、表达与修饰研究

张希东  
【摘要】: 目的 合成编码支原体精氨酸脱酰酶(Arginine Deiminase,ADI)的基因,构建原核表达载体,获得高水平表达支原体精氨酸脱酰酶的工程化菌种;探索用聚乙二醇修饰支原体精氨酸脱酰酶的反应条件,建立PEG化支原体精氨酸脱酰酶(PEG-ADI)的制备工艺;探索修饰混合物的分离纯化工艺,获得PEG-ADI纯品;建立活性测定方法,并研究修饰物活性。 方法 采用化学合成方法和DNA聚合酶链式反应(PCR)合成编码支原体精氨酸脱酰酶的基因。采用pBV220质粒构建原核表达载体,转化大肠杆菌DH5α,筛选氨苄青霉素抗性克隆。采用5升发酵系统进行发酵研究。采用分子量20kD的聚乙二醇修饰精氨酸脱酰酶。探索温度、搅拌、反应时间等因素对反应效率的影响。采用凝胶层析等方法对修饰产物进行分离纯化。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白质分子量;采用C18反向高效液相色谱分析修饰产物纯度;采用体外精氨酸降解方法研究修饰产物的活性。 结果 我们获得了编码支原体精氨酸脱酰酶的全长DNA,成功构建了原核表达载体pBV220-ADI,获得了表达支原体精氨酸脱酰酶的大肠杆菌菌种,目标蛋白表达量占全菌蛋白的30%以上;表达产物主要以包含体形式存在;发酵实验表明工程菌能够大规模制备,表达稳定;建立了聚乙二醇修饰精氨酸脱酰酶的化学反应工艺;建立了修饰产物的分离纯化工艺。通过二次凝胶排阻层析方法可以充分分离单一修饰产物,获得了单修饰产物纯品;成功建立了精氨酸降解法来测定产物活性的质量控制方法,未修饰ADI与PEG-ADI的比活性分别为40IU/mg和30IU/mg;聚丙烯酰胺凝胶电泳检测ADI和PEG-ADI的分子量分别约为45kD和65kD;高效液相检测结果显示PEG-ADI纯度大于95%。 结论 本研究通过原核表达系统获得了支原体精氨酸脱酰酶的高效表达。表达产物以包含体形式存在于细胞质内。小试发酵表明该菌种可以进行放大生产,这为继续进行ADI深层次研究奠定了基础;建立了优化的聚乙二醇修饰精氨酸脱酰酶的反应条件,明确了最佳反应参数,为大规模制备PEG-ADI提供了前提;研究还建立了简便、高效的反应混合物分离纯化工艺路线,为聚乙二醇修饰物的制备提供了坚实的下游工程技术保障;研究还建立了采用体外精氨酸降解法来测定产物活性的质量控制方法,为该活性物的深入研究提供了方便的检测和控制手段。本研究为肝癌治疗提供了一个新的活性物质,具有重要的学术意义和临床应用价值。
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R341

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