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《中国医科大学》 2007年
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中国北方地区HIV-1 B’nef基因多态性及其对疾病进展影响的研究

董西华  
【摘要】: 前言 HIV-1 nef基因是影响疾病进程的重要因素之一,其多态性可能影响HIV-1的感染和AIDS的疾病进程。调节因子Nef是一个具有多种效应功能的蛋白质,对人体内病毒复制和AIDS的发病起到重要作用。国外对B亚型、CRF01_AE和SIV的研究表明nef基因的缺陷或缺失与HIV感染后疾病长期不进展相关。但对印度C亚型感染者的研究却不支持此结论。由于nef存在基因多态性,是否由于不同亚型、不同人群氨基酸序列的突变位点而导致疾病进展不同呢?B’亚型在中国流行最为广泛,中国HIV-1感染人群nef基因多态性对疾病进程的是否产生影响呢?本研究拟通过对我国B’亚型HIV-1感染者病毒基因组中nef的系统进化和氨基酸序列多态性的分析,明确中国感染HIV-1 LTNPs是否存在nef基因的缺陷和变异,及其对HIV-1疾病进展有无影响;评估nef基因的重要功能区的保守程度。为深入了解我国HIV的治病机理提供科学的依据。 方法 收集我国HIV感染者的流行病学资料、临床资料及全血标本。HIV-1 nef基因序列测定:QIAamp Blood Mini Kit(德国)从全血标本中提取基因组DNA(含有整合的HIV-1前病毒DNA),提取的DNA以nef基因区特异性引物O1、O2为外侧引物进行第一轮PCR扩增,以I1、I2为内侧引物进行nested-PCR扩增。1%琼脂糖凝胶电泳检测目的扩增片断,与分子量Marker对比无误后,用德国Qiagen公司的Gel Extraction Kit试剂盒对PCR产物进行纯化,使用美国Applied Biosystem公司的BigDye Terminator Sequencing试剂盒和ABI 3130型DNA测序仪测序。不同疾病进展阶段的HIV-1感染者体内HIV-1核苷酸及氨基酸序列特征分析:按不同疾病进展阶段对我国HIV-1感染者进行分组。使用BIOEDIT软件包中CLASTAL W程序进行序列排列比对,并在核苷酸序列中人工引人gaps以保持翻译完整性。并在此基础上以Mega 3.1用DNADIST程序(Kimura's two parameters method)计算我们测得的nef序列核苷酸及氨基酸离散率,使用NEIGHBOR程序生成系统进化树(neighbor-joining algorithm)。统计nef基因区核苷酸及氨基酸突变位置和种类,并检索HIV Sequence Database,与国内外HIV流行株序列进行比较。用SPSS11.5统计软件统计分析,Yates校正的χ~2检验并计算P值或双尾Fisher's精确概率检验计算两组氨基酸突变频率的差异。基因突变与疾病进程相关程度用比值比(Odds ratio,OR)计算。 结果 1、中国北方地区HIV-1感染者nef序列种系发生分析 中国北方地区72个HIV-1感染者核苷酸序列与M群的其他亚型nef标准株做成无根树,可以看到所有序列都在同一枝下,说明72个nef序列都为B’亚型。72个核苷酸序列种系发生分析表明,所有nef序列都在系统进化树的同一枝下,并与B.CN.02.02HNsq4有最近的亲缘关系,表明它们全部为B’亚型。LTNP组与TP组患者呈混合分布,无明显集中分布的倾向性。 2、中国北方地区LTNP组与TP组nef基因离散率 计算LTNP组及TP组毒株nef区序列与欧美B、泰国B亚型以及中国流行参考株(B’、A/E、B’/C)序列的离散率,发现LTNP组及TP组与中国B’亚型参考毒株B.CN.02.02HNsq4的基因距离最近,分别为5.09±0.61和5.17±0.61,略低于的两组组内基因离散率(分别为5.12±0.37和5.28±0.38)。 3、中国北方地区nef氨基酸序列重要功能区多态性分析 通过对nef氨基酸序列分析可以看出,发生氨基酸变异、缺失和插入等变异的序列,相应功能区的功能可能受到影响。 4、中国北方地区LTNP组和TP组患者nef氨基酸序列的比较 (1)中国北方地区LTNP组和TP组氨基酸缺失或插入的比较:LTNP组和TP组各有1例发生8、9号位缺失;TP组有4例发生10号位缺失,而LTNP组只有1例;TP组有3例,LTNP组有1例发生11号位缺失;38-41号位只在LTNP组的1例有4个氨基酸缺失;酸性区域(EEEE)后在TP组有5例E/G插入;TP组有2例出现156号位缺失。以上氨基酸缺失或插入在两组间比较无统计学差异。 (2)中国北方地区LTNP组和TP组各位点氨基酸变异的比较:S15有R、K、N取代,但以R为主,TP组(64.29%)突变频率高于LTNP组(33.33%),两组相比有统计学差异(P<0.01),OR=3.60(C195%1.21-10.97);豆蔻酰化信号后的长度可变区域中,有R21→K/E/H/I/Q,以K为主,TP组和LTNP组的突变频率分别为59.52%和93.33%,两组相比有统计学差异(P<0.005),OR=0.11(C195%0.02-0.55);蛋白酶加工位(CAWLEAQ)前的39号位发生K被E、R、N取代,但以R为主,TP组和LTNP组突变频率分别为23.81%和0,两组相比有统计学差异(P<0.005)。其他位点的氨基酸变异经过统计分析在两组无差异。 结论 1、中国北方地区HIV-1 B’亚型nef基因无明显缺失或缺陷; 2、中国北方地区HIV-1 B’亚型nef基因的缺失和缺陷与疾病长期不进展无相关性; 3、中国北方地区HIV-1 B’亚型nef基因序列21位K、E、H、I、Q取代R可能与疾病缓慢进展有关; 4、中国北方地区HIV-1 B’亚型nef基因序列15位R、K、N取代S、39位R、E、N取代K,可能与疾病进展相关; 5、中国北方地区HIV-1 B’亚型nef氨基酸序列的重要功能区较为保守。
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R512.91

【参考文献】
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