收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

亚慢性过量氟暴露对大鼠CRP、C3、C4及Lc影响的研究

宫建  
【摘要】: 前言 地方性氟中毒(endemic fluorosis,简称地氟病)是世界上、也是我国危害最严重的地方病之一,其主要的临床表现包括氟斑牙、氟骨症和氟性骨关节炎。重度地氟病患者可出现关节僵硬及运动障碍,甚至出现躯干变形和终生瘫痪,但是目前对于地氟病尚缺乏有效治疗方法的报道,只能以预防为主,而对于炎症的治疗已经比较成熟。另外,传统的观察指标氟斑牙、氟骨症尽管特异性好,但是不够敏感,也基本不可逆。炎症细胞因子C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)、淋巴细胞(lymphocyte,Lc)、补体C3(complement C3,C3)和补体C4(complement C4,C4)以其敏感和可逆的特点已引起了我们的关注。 CRP是由肝细胞合成的一种炎症反应蛋白,是慢性炎症状态最敏感的观察指标,血清CRP的升高提示存在长期、慢性的低度炎症状态。Lc是一种具有特异性免疫功能的白细胞,它在机体内占白细胞的百分比是相对稳定的,但当机体发生慢性炎症时,Lc的比例将增加。补体是人类或动物体液中正常存在的一组与免疫有关并具有酶活性的球蛋白,是非特异性免疫系统中极为重要的组成部分之一,参与机体的防御功能和自稳状态。C3是补体经典激活途径与旁路激活途径的中心环节。在炎症反应中,C4比C3更敏感,而且它还是补体经典激活途径的一个重要组分。补体C3、C4值的升高与降低,随机体不同的炎症状态而改变。 以往对CRP的研究多集中于急性感染和慢性炎症性疾病,对Lc、C3和C4的应用也多集中于炎症反应的非特异性标志物方面,在地氟病的研究中均未见报道。本研究旨在通过动态观察亚慢性氟中毒大鼠炎症细胞因子CRP、Lc、C3和C4的表达水平,探讨慢性氟中毒过程中是否伴随有炎症反应因子水平的改变,进而为地氟病的有效治疗和寻找敏感、可逆的地氟病防治效果评价指标提供理论依据。 材料和方法 一、动物分组 选用中国医科大学实验动物中心提供的离乳一周健康Wistar大鼠42只,雌雄各半,体重80±10克,按体重均衡原则随机分为3组,每组亦雌雄各半。喂饲全营养颗粒大鼠饲料,自由饮用不同浓度的氟化钠配置的自来水。实验周期为3个月。 具体分组情况如下: 对照组:饮用自来水,含F~-量为0.31 mg/L; 低剂量组:饮用水中含F~-量为100mg/L; 高剂量组:饮用水中含F~-量为200mg/L。 二、主要试剂与仪器 氟化钠、氯化钠、柠檬酸三钠、冰醋酸、氢氧化钠、盐酸、水合氯醛、多聚甲醛、无水乙醇、石蜡、苏木精、伊红, Beckman Coulter Immage配套试剂:①稀释液(硫酸钠、氯化钠、二羟甲基脲、盐酸普鲁卡因)、②清洗液(表面活性剂和蛋白酶、不含叠氮化合物)、③溶血剂Ⅰ(季铵盐、异丙醇、氰化钾)、④散射包(Ⅰ.溶血剂Ⅱ:润湿剂、甲酸[蚁酸],Ⅱ.抑制剂:碳酸钠、氯化钠、硫酸钠)。 氟离子选择电极、Beckman Coulter Immage血生化分析仪、电子天平、体重称、-70℃冰箱、光学显微镜。 三、实验方法 (一)标本采集及处理 采用大鼠代谢笼收集隔夜尿样,用于尿氟的测定。经大鼠眼眶内眦静脉丛或腹主静脉(或右心房)采血,分离血清,用于血氟、血清CRP、Lc、C3和C4的检测。采集实验大鼠的肝脏,用于脏器病理学检查。采集大鼠胫骨,用于骨骼病理学检查。 (二)肝脏、骨骼组织形态学观察 样品分别为肝脏组织块和胫骨。 1、石蜡切片的制作过程 固定:4%多聚甲醛,4℃12h。 脱水:70%、80%、90%的乙醇,依次使用4℃12h;然后采用95%的乙醇,室温40分钟;100%的乙醇,室温20分种,2次。 透明:新鲜二甲苯,室温6分钟,2次。 浸蜡、包埋:熔化的石蜡,60℃30分钟。 切片:切成3—5μm的薄片。 2、HE染色 脱蜡:二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各置10分钟,100%乙醇Ⅰ、Ⅱ各置5分钟。 水化:95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇各置3分钟,DDW置1分钟。 苏木精染色5-10分钟。 1%盐酸酒精分化数秒。 水洗返蓝10-20分钟。 伊红染色5-10分钟。 水洗5-10分钟。 脱水:75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇各置1分钟,100%乙醇Ⅰ、Ⅱ各置2分钟。 透明:二甲苯Ⅰ、Ⅱ各置3分钟。 封片:滴加中性树胶适量,覆盖盖玻片。 四、血清CRP、Lc、C3和C4水平测定 采用免疫比浊法测定大鼠血清中CRP、C3和C4的水平。采用流式细胞分析法检测大鼠血清中Lc的水平。 检测仪器Beckman Coulter Immage工作原理:根据流体力学的原理,应用VCS三种技术同时检测(VCS技术即容量、电导、光散射法来检测血液细胞的一种新技术)。 五、大鼠氟斑牙分度方法 根据以下对氟斑牙的分度方法,每隔2周检查氟斑牙的发生情况。具体分度标准如下。 分度(记分)牙齿表现 正常(0)釉质呈棕黄色半透明、光滑、有光泽。 轻度(1)釉质变白或出现棕白相间条纹,光滑性和光泽度改变不明显。 中度(2)釉质表面粗糙、无光泽,可见棕色色素沉着、浅表凹坑状缺损。 重度(3)一颗以上切齿明显磨损、变短,甚至缺失。 六、统计学处理 采用SPSS13.0软件创建数据库,采用单因素方差分析方法和重复测量方差分析比较各组间差异。方差不齐时,采用Welch近似方差法得出F值。满足方差齐性时的两两比较采用LSD法(Least-significant Difference,最小显著差值法),不满足方差齐性时的两两比较采用Tambane′s T2法。重复测量方差分析不满足球形检验(Mauchly′s test of sphericity)时采用Greenhouse-Geisserε校正系数来校正自由度。方差分析检验水准α=0.05,方差齐性检验水准α=0.1。 七、质量控制 (一)实验大鼠的饲养和实验环境的规范化,以保证实验的正常开展。 (二)检测条件的控制,以保证所有仪器和辅助条件在实验期间内准确可靠,长期稳定可比;试剂在使用期间均放置在冰箱内冷藏过夜。 (三)严格执行结果检测标准,动态、密切地观察检测过程各项指标的变化,剔除个体差异过大的数值。 (四)标本采集操作的规范化和标本检测过程中应用盲法,避免主观因素对实验结果的影响。 (五)正确应用统计学检验方法。 实验结果 一、大鼠氟斑牙的发生情况 实验第1个月末,高剂量组有60%的大鼠出现轻度氟斑牙。实验第2个月末,高剂量组有80%的大鼠氟斑牙发生中度氟斑牙,另有6.7%的大鼠发生重度氟斑牙;同时,低剂量组有60%的大鼠发生中度氟斑牙。至染毒3个月末时,100%的染氟组大鼠出现中度氟斑牙,其中高剂量组有20%的大鼠发生重度氟斑牙。 二、尿氟水平 不同染氟剂量组(低剂量组或高剂量组)大鼠尿氟水平随时间的延长而增加,差别有统计学意义(F=122.796,P=0.000),染氟剂量与测定时间之间有交互作用(F=32.490,P=0.000);不同时间点,大鼠的尿氟水平随染氟剂量的增加而升高,差别有统计学意义(F=6427.512,P=0.000)。 三、血清氟水平 不同染氟剂量组(低剂量组或高剂量组)大鼠血清氟水平随时间的延长而升高,差别有统计学意义(F=78.947,P=0.000),染氟剂量与测定时间之间有交互作用(F=19.351,P=0.000);不同时间点,大鼠的血清氟水平随染氟剂量的增加而升高,差别有统计学意义(F=1295.079,P=0.000)。 四、血清CRP水平 不同染氟剂量组(低剂量组或高剂量组)大鼠血清CRP水平随时间的改变差别没有统计学意义(F=0.939,P=0.346),染氟剂量与测定时间之间没有交互作用(F=0.965,P=0.397);不同时间点,大鼠的血清CRP水平随染氟剂量的增加而升高,差别有统计学意义(F=8.019,P=0.009)。 五、血清补体C3水平 不同染氟剂量组(低剂量组或高剂量组)大鼠血清C3水平随时间的延长而降低,差别有统计学意义(F=15.118,P=0.000),染氟剂量与测定时间之间有交互作用(F=3.488,P=0.024);不同时间点,大鼠的血清C3水平随染氟剂量的增加而降低,差别有统计学意义(F=15.067,P=0.000)。 六、血清补体C4水平 不同染氟剂量组(低剂量组或高剂量组)大鼠血清C4水平随时间的延长而降低,差别有统计学意义(F=43.345,P=0.000),染氟剂量与测定时间之间有交互作用(F=11.891,P=0.000);不同时间点,大鼠的血清C4水平随染氟剂量的增加而降低,差别有统计学意义(F=61.688,P=0.000)。 七、血清Lc水平 不同染氟剂量组大鼠血清Lc水平随时间的延长而增加,差别有统计学意义(F=25.870,P=0.000),染氟剂量与测定时间之间有交互作用(F=8.856,P=0.000);不同时间点,大鼠的血清Lc水平随染氟剂量的增加而增加,差别有统计学意义(F=45.472,P=0.000)。 八、骨组织、肝脏的形态学观察结果 随染氟剂量的增加,大鼠胫骨近端骺板增生明显活跃,骨小梁数目增多、增粗,甚至出现硬化型改变;肝细胞肿胀、变性程度加重,坏死肝细胞增多。 讨论 一、亚慢性氟中毒大大鼠模型的制备 氟斑牙是唯一可用肉眼观察到的慢性氟中毒早期临床体症,可以特异、直观地反映氟对牙组织形态结构的毒性损伤程度。实验第1个月末,高剂量组即有60%的大鼠出现轻度氟斑牙。实验第2个月末,高剂量组有80%的大鼠发生中度氟斑牙,另有6.7%发生重度氟斑牙;同时,低剂量组有60%的大鼠发生中度氟斑牙。因此本实验通过氟斑牙的观察来判定氟中毒模型的复制情况。 在多次用大鼠、家兔所做的氟中毒实验中,通常2-3个月病变即发展得很充分。染氟时间延长,则有些病变反而变得不明显。原因一方面是动物对持续高氟环境有所适应;另一方面是大量原有病变进入修复阶段。因此,本次实验采用3个月的实验周期复制亚慢性氟中毒的动物模型,并每隔1个月观察1次实验动物的血清CRP、C3、C4、Lc水平改变情况,连续观察3次,以便动态掌握过量氟暴露大鼠机体细胞炎症因子水平变化的特征,观察炎症反应的发展过程。 二、机体氟水平和炎症因子水平的改变 在本实验中,大鼠血清氟和尿氟含量随染氟剂量增加而增加,且差别有统计学意义;但血清氟含量在3个月的染氟周期中始终保持在一个较低的水平,验证了机体通过骨氟大量沉积和尿氟加速排泄的代偿性调节,尽可能使血氟水平保持在恒定状态,以避免重要的生命脏器遭受过量氟化物的侵袭。 本实验观察到大鼠血清CRP含量随染氟剂量增加而增加,在实验第1个月末时,各组间差别即有统计学意义,而此时低剂量组大鼠的氟斑牙改变并不明显,提示血清CRP水平较氟斑牙对氟的刺激可能更敏感;此后随染氟时间的延长,CRP水平逐渐升高,提示炎症状态的存在。在慢性炎症反应中,CRP的水平可以长期恒定不变,而本次实验的结果也证实了在同一染氟剂量组内,CRP的水平并不随染氟时间的延长而改变。 本实验还检测到补体C3、C4均随染氟时间、剂量的增加而降低。但实验第1个月末,仅C4各组间的差别有统计学意义,实验结束时差别更明显;C3在实验第2个月末时差别才有统计学意义,验证了C4较C3敏感,也提示实验第1个月末时,即有免疫抑制的出现。过量氟可能激活经典途径及旁路途径,消耗补体,使血中补体C3、C4水平降低。另外,实验结果显示C4的改变也较氟斑牙更加敏感,它更早地表现出阳性结果,因此C4也可能作为氟中毒损伤的早期血清学标志,并且C3、C4水平的变化也提示着氟中毒发病过程中炎症反应的存在。 Lc的比例随染氟剂量的增加和染氟时间的延长而增大,实验第1个月末,各组间的差别即有统计学意义,也提示机体存在慢性炎症反应。 三、病理学改变 本试验观察到染氟组大鼠肝组织多数区域肝细胞肿胀、变性,偶见坏死肝细胞;与以往的研究结果类似。而这些病理改变,与炎症反应的病理过程十分符合。另外,光镜下观察到染氟大鼠出现骨皮质增厚,骨小梁增生,与以往报道的X线观察到关节软骨钙化变性、坏死、软骨下骨性增生相似,同样也提示着炎症状态的存在。 结论 在亚慢性过量氟暴露的条件下,随染氟剂量的增加和染氟时间的延长,大鼠血清CRP、Lc水平逐渐升高,但补体C3、C4水平逐渐降低;C4比C3更加敏感。染氟第1个月末,在染氟组即出现CRP、Lc和C4水平的改变,尤其是在低剂量组,这种改变早于氟斑牙的出现。提示炎症因子CRP、Lc、C3和C4水平可能作为氟中毒所致炎症反应的血清学标志。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 李树培,阎成运;吉林省氟病区环境特征及其演化[J];中国地方病学杂志;1987年01期
2 许鹏,郭雄;氟中毒对胶原代谢影响的研究现状[J];国外医学.医学地理分册;1998年04期
3 徐辉,张桂珍,赵建华,张文岚,李广生;不同氟中毒动物模型肾脏功能与离子代谢的变化[J];中国地方病防治杂志;2001年06期
4 徐辉,孙波,赵志涛,张桂珍,李广生;慢性氟中毒大鼠肾组织细胞凋亡的实验研究[J];中国地方病学杂志;2002年04期
5 赵宝林,宣昭林,张忠君;氟中毒对骨生物力学性质影响实验研究[J];中国地方病防治杂志;2002年06期
6 晓开提·依不拉音,韩英,热依汗;吐鲁番干热氟中毒地区改水后的短期防治效果研究[J];微量元素与健康研究;2002年03期
7 刘丽杰;陈新秋;刘长晟;;沈阳市改水地区降氟设施使用状况及氟中毒调查[J];沈阳医学院学报;2006年02期
8 胡浴桓;吴锡雄;;脑脊液中的氟[J];农垦医学;1986年01期
9 蒋时曜;韩继杰;;露天堆放萤石污染水源引起95例氟中毒[J];浙江预防医学;1991年05期
10 李玉坤,白成江,张鑫,邱明才;中等剂量氟对大鼠股骨骨计量参数影响的动态研究[J];天津医药;1994年06期
11 麻熙乐,臧增元,周明河;硼治疗氟中毒国内外研究进展[J];中国公共卫生;1994年08期
12 于燕妮,刘家骝,王守立,高勤,梁任又,金嗣昭,徐云华;慢性氟中毒大鼠骨骼自由基含量及病理形态学研究[J];中国地方病学杂志;2000年05期
13 夏东,钟山,汪炳华,郭煜;实验性氟中毒小鼠毛发中几种微量元素含量的研究[J];氨基酸和生物资源;2000年02期
14 刘晓秋,张秀云,李广生;自由基与氧化应激在氟中毒骨病变发生中的作用[J];中国地方病防治杂志;2001年01期
15 徐辉,崔亚南,张桂珍,李广生;氟中毒大鼠肾组织形态改变与氧化应激[J];中国地方病防治杂志;2002年05期
16 边建朝,王海明;硒及有关抗氧化物质拮抗氟的研究[J];中国地方病学杂志;2004年04期
17 黎昌健;蒙衍强;蒋才武;;地氟病在中国大陆的流行现状[J];实用预防医学;2008年04期
18 李彩双;谭郁彬;尹潍;樊继援;梁雪萍;;氟中毒过程血氟变化机制的初步探讨[J];天津医药;1987年05期
19 程柏,苏平,白世成,邹黎明;胶原酶抑制因子在氟中毒发病学中意义的研究[J];中国地方病学杂志;1992年01期
20 刘笑春;饮砖茶须防氟中毒[J];健康大视野;1995年03期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 王金明;霍梅俊;罗广营;王俊东;;蛋白质和钙对氟中毒家兔骨骼矿物质成分的影响[A];中国畜牧兽医学会家畜内科学分会第七届代表大会暨学术研讨会论文集(上册)[C];2011年
2 张树球;梁伟江;李友晶;黄丹;何春霞;梁瑞梅;李兰锋;唐娟;韦燕梅;赖文娟;;海尔福治疗氟中毒小鼠的实验研究[A];广西生物化学与分子生物学会第六次学术研讨会论文摘要[C];2003年
3 梁伟江;张树球;李友晶;何春霞;黄丹;蒙元波;黄婵兰;;海尔福对氟中毒小鼠骨胶原蛋白保护作用的实验研究[A];广西生物化学与分子生物学会第六次学术研讨会论文摘要[C];2003年
4 王凯英;李光玉;;鹿氟中毒原因及防治[A];二○○三年全国鹿业发展信息交流会材料汇编[C];2003年
5 崔亚南;徐辉;张桂珍;;氟中毒肾损害的图像分析研究[A];第五届全国生物医学体视学学术会议、第八届全军军事病理学学术会议、第四届全军定量病理学学术会议论文汇编[C];2002年
6 刘敏;陈乾美;龚正鹏;僧东杰;;燃煤型氟中毒对听觉功能影响的畸变产物耳声发射的研究[A];中华医学会第十次全国耳鼻咽喉-头颈外科学术会议论文汇编(上)[C];2007年
7 马品江;李菁;朱殿志;徐也晴;;新疆阿瓦提县氟中毒与地理环境关系的研究[A];第六届全国环境地球化学学术讨论会论文摘要汇编[C];2002年
8 李树海;潘晶岩;刘学慧;周明仁;刘庆斌;;呼伦贝尔市饮茶型中毒调查[A];2003年内蒙古自治区自然科学学术年会优秀论文集[C];2003年
9 谢春;张华;周琳业;方士杰;葛庆华;何江;张震;喻茂娟;;燃煤型氟中毒对骨代谢影响的研究[A];中国环境诱变剂学会抗诱变剂和抗癌剂专业委员会第三次全国学术会议、中国毒理学会生化与分子毒理专业委员会第五届学术交流会、贵州省环境诱变剂学会成立大会暨首届学术交流会论文集[C];2004年
10 高艳玲;黄厚今;;氟对大鼠脑Cu/Zn-SOD蛋白表达的影响[A];中国环境诱变剂学会第14届学术交流会议论文集[C];2009年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 孙述海;吉林西部氟中毒区地氟病与水文地球化学关系的研究[D];吉林大学;2012年
2 刘国艳;鸡氟中毒的毒理学研究[D];东北农业大学;2000年
3 徐辉;细胞内Ca~(2+)浓度、氧化应激、骨桥蛋白在氟中毒肾损害发生发展中的作用及氟中毒大鼠肾组织蛋白质组研究[D];吉林大学;2004年
4 李丹;Runx2在过量氟激活成骨细胞过程中的作用研究[D];吉林大学;2006年
5 高彦辉;BMPs与MMPs在氟中毒骨转换过程中的协同作用及调控机制[D];哈尔滨医科大学;2005年
6 范哲;过量氟对几种非胶原蛋白和转化生长因子β表达的影响[D];吉林大学;2006年
7 钱聪;低营养状态下氟致硬组织和DNA损伤及营养干预及其机制的实验研究[D];中国医科大学;2004年
8 钟近洁;氟对成骨细胞增殖及其MCM3基因表达的影响[D];新疆医科大学;2006年
9 贾丽红;氟致大鼠肝、肾细胞损伤机制及抗氧化营养素的干预性研究[D];中国医科大学;2002年
10 郭晓英;氟对大鼠肝脏功能和形态的影响及与氧化应激关系的实验研究[D];中国医科大学;2003年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 朱玲;衡阳市氟中毒病区农作物与土壤氟含量关系研究[D];南华大学;2009年
2 宫建;亚慢性过量氟暴露对大鼠CRP、C3、C4及Lc影响的研究[D];中国医科大学;2007年
3 梁大刚;氟中毒对家蚕幼虫体内谷胱甘肽(GSH)代谢的影响[D];浙江大学;2004年
4 张莹;骨保护蛋白与慢性氟中毒大鼠骨质硬化关系的研究[D];中国医科大学;2005年
5 穆金萍;不同钙营养状态下骨保护蛋白配体与慢性氟中毒大鼠骨质改变关系的研究[D];中国医科大学;2006年
6 颜泽清;犬肾脏黄嘌呤结石的形成原因及其营养调控[D];南京农业大学;2006年
7 杜宇欣;天津市农村饮水降氟措施卫生技术评估及优化方案研究[D];天津医科大学;2007年
8 王春艳;内质网应激及氧化应激在氟中毒肾损害机制中的地位[D];吉林大学;2009年
9 秦港;公鸡慢性氟中毒生殖毒性研究[D];西南大学;2006年
10 姬一兵;氟中毒患者脂质过氧化物与抗氧化物的水平和防氟改水对其影响的研究[D];中国医科大学;2002年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 记者 黄岚;贵州90万人解除或减轻氟中毒危害[N];健康报;2009年
2 本报记者 李静;全州41万农村群众远离氟中毒[N];黔西南日报;2010年
3 本报记者 刘志强;氟中毒病治标更要治本[N];科技日报;2005年
4 本报特约专家 刘纳;喝浓茶能导致氟中毒?[N];健康时报;2005年
5 王邻 杨春凌;1500万病区群众摆脱世代“宿命”氟中毒[N];贵州日报;2011年
6 秦亚洲;氟中毒令四千万人“笑不敢露齿”[N];新华每日电讯;2005年
7 石云华;贵州氟中毒:黏土氟是真凶[N];地质勘查导报;2005年
8 ;中科院专家揭秘氟中毒真相[N];贵州日报;2005年
9 熊和生 秦亚洲;科学家查明我国西南地区氟中毒“真凶”[N];大众科技报;2005年
10 朱述古;“氟中毒”事件考验执政理念[N];农民日报;2005年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978