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《中国医科大学》 2007年
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负载凋亡的肺腺癌细胞致树突状细胞成熟并增强自然杀伤细胞的细胞毒作用研究

温华  
【摘要】: 树突状细胞(dendritic cell,DC)是免疫系统主要的抗原提呈细胞(antigen presenting cell,APC),其在固有免疫反应和适应性免疫反应中均有重要作用。但就肺腺癌而言,其抗原刺激DC成熟的最佳方式以及负载肺腺癌抗原后的DC与自然杀伤细胞(natural killer,NK)间相互作用的机理尚不完全清楚。 目的 用凋亡(1.33μmol/L顺铂所致)以及(热休克、反复冻融和5.32μmol/L顺铂所致)坏死的肺腺癌A549细胞作为肿瘤相关抗原(tumor associated antigen,TAA),分别刺激人外周血单核细胞来源的DC(monocyte-derived DC,mo-DC)。通过比较凋亡和坏死的A549细胞对mo-DC表型、超微结构和白介素(interleukin,IL)-12分泌量的影响,来评估二者对诱导mo-DC成熟能力的影响,同时观察凋亡的肺腺癌A549细胞所诱导成熟的mo-DC(A-DC)对NK细胞杀伤能力的影响。 材料与方法 体外诱导DC,并用不同实验条件下所得的TAA负载于DC;流式细胞术测定DC表面标志,电镜观察DC形态和超微结构,ELISA法测定IL-12分泌量;流式细胞术和Hoechst染色判定A549细胞凋亡;4h-~(51)Cr释放法测定A-DC对CD56+NK细胞杀伤K562细胞能力的影响。 结果 (1)顺铂浓度为1.33μmol/L时,A549细胞凋亡率可达19.7%,细胞大多被阻滞在G1期;顺铂浓度为5.44gmol/L时,A549细胞几乎全部死亡。(2)扫描电镜下可见DC伸展出大量大小不一、扁平的胞质突起,其末端圆钝且细胞膜光滑无皱折。成熟的DC(mature DC,mDC)于不成熟的DC(immature DC,iDC),但表面突起较iDC减少。(3)透射电镜下可见DC的胞体周围有不规则突起和褶皱;胞核染色深,偏向一侧,形状不规则,多为分叶状,内异染色质沿核边高度凝聚;胞质线粒体较为丰富,较多吞饮大泡及小泡。mDC胞体周围突起较iDC减少。(4)人DC特异性表面标志CD1a为68.7%。不同实验条件(L-DC、H-DC、A-DC和N-DC)刺激下DC的表面标志HLA-DR分别为6.98%、34.12%、39.49%、19.13%,CD80分别为11.2%、40.55%、54.33%、49.76%。A-DC的表面标志HLA-DR显著高于L-DC和N-DC的表达(P<0.01),但与H-DC表达相近(P>0.05);A-DC与N-DC表面均高表达CD80,虽然前者略高于后者,但二者间无显著性差异(P>0.05)。(5)DC和L-DC仅能分泌少量IL-12,其细胞上清液浓度低于20 pg·ml~(-1);H-DC、N-DC和A-DC分泌IL-12的能力增强,其细胞上清液浓度分别为(201.5±30.3)、(41.2±5.9)和(289.7±45.2)pg·ml~(-1)。N-DC的IL-12分泌量较DC和L-DC有增加,H-DC和A-DC的IL-12分泌量均明显增加,与其余各组间有显著性差异(P<0.01),其中尤以A-DC的IL-12分泌量最高,与H-DC间差异显著(P<0.05)。(6)与NK细胞对K562的裂解能力比较,DC和A-DC均能使NK细胞对K562的杀伤能力增强,而且差异显著(P<0.01):在DC作用下,当效靶比(effector:target,E:T)为5、10和20时,NK细胞对K562细胞的裂解率分别为(3.7±0.96)%、(18.33±2.29)%和(46.8±3.39)%;在A-DC作用下,E:T为5、10和20时,NK细胞对K562细胞的杀伤能力进一步增加,其裂解率分别为(13.33±0.76)%、(33.67±1.19)%和(55.87±2.50)%。(7)当A-DC的上清液加入NK细胞时,NK细胞对K562细胞的杀伤能力显著增加,如E:T为20时,K562细胞裂解率为(45.73±0.06)%,而未加A-DC时K562细胞裂解率(10.7±0.529)%(P<0.01)。(8)当E:T为20时,NK细胞对K562细胞的裂解率是(47.1±0.96)%;加入干扰素(interferon,IFN)-γ后,NK细胞对K562细胞的裂解率是(46.9±4.85)%,与NK细胞对照组无显著差异(P>0.05);加入IL-12后,NK细胞对K562细胞的裂解率是(61.1±1.57)%,与另外二组差异显著(P<0.01)。(9)当E:T为20时,NK细胞对K562细胞的裂解率是(19.2±0.82)%;加入A-DCsup后,NK细胞对K562细胞的裂解率是(48.9±3.84)%,与NK细胞对照组差异显著(P<0.01)。加入IFN-γab后,A-DCsup作用下的NK细胞对K562细胞的裂解率是(45.3±1.31)%,与A-DCsup组无显著差异(P>0.05);加入IL-12ab后,是(48.1±0.49)%,与A-DCsup组无显著差异(P>0.05)。 结论 1、顺铂所致凋亡的A549细胞能刺激DC成熟。 2、iDC通过细胞间接触,增强NK细胞的细胞毒作用。 3、A-DC通过细胞间接触和分泌细胞因子的方式,增强NK细胞的细胞毒作用。 4、A-DC可通过IL-12和IFN-γ以外的细胞因子活化NK细胞的细胞毒作用。
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R734.2

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