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《中国医科大学》 2007年
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舌鳞状细胞癌中Survivin、Caspase-3、VEGF的相关性及紫杉醇体外抗舌癌作用

王智明  
【摘要】: 前言及目的 在我国,舌鳞状细胞癌是口腔恶性肿瘤中最常见的,一般恶性程度较高,生长快,浸润性较强,常波及舌肌,致舌运动受限,影响进食、吞咽、语音等重要功能。常发生早期颈淋巴结转移,且转移率较高,舌癌可发生远处转移,一般多转移至肺部。虽然手术技术及辅助治疗手段不断完善,5年生存率仍约为5-10%。 Survivin是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins,IAP)家族中最新发现的成员,是迄今发现的最强的凋亡抑制因子。其分布具有组织特异性,在大多数恶性肿瘤中高表达,而且与肿瘤生物学、临床病理特征有一定联系。在细胞凋亡的信号途径中,半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶-3(cysteinyl aspartate-specific protease-3,Caspase-3)处于细胞凋亡的下游,是凋亡的主要效应分子。Survivin直接或间接地抑制Caspase-3而促进肿瘤发生。 近年来的研究发现,Survivin与血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的高表达与肿瘤的转移、肿瘤的血管生成有密切关系。可能是因为Survivin抗凋亡的特性,保护了血管内皮,调控了一些血管生长因子的活性而参与肿瘤血管生成。 紫杉醇(Paclitaxel)是近年来从红豆杉中分离出的一种化合物,紫杉醇属于有丝分裂抑制剂,它可以稳定微管聚合,抑制细胞分裂,使细胞停留在G2/M期,从而诱导细胞凋亡。该化合物在体外对卵巢癌等肿瘤细胞株有明显的抑制作用,目前临床上用于卵巢癌、乳腺癌、肺癌、食道癌的治疗。 目前关于紫杉醇抗舌鳞癌的作用机制及对Survivin表达影响的研究较少,关于Survivin、Caspase-3、VEGF在舌癌中的凋亡作用及新生血管形成的报道也较少。本实验采用原位杂交的方法检测舌鳞癌中Survivin mRNA、Caspase-3 mRNA的表达,探讨二者的相关性及与舌癌临床病理特征之间的关系。采用免疫组织化学pv-9000方法检测舌癌中Survivin与VEGF蛋白的表达,研究舌癌中血管生成、转移方面二者是否存在相关性及与舌癌临床病理特征间的关系。采用流式细胞仪检测紫杉醇对舌癌细胞细胞周期的影响及应用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reac-tion,RT-PCR)检测紫杉醇对舌癌中Survivin mRNA的影响,为研究舌鳞癌的发生、发展机制,舌癌的转移及新生血管形成,及临床应用紫杉醇抗舌癌提供理论依据。 实验材料与方法 本实验收集45例舌鳞状细胞癌标本,10例正常舌粘膜标本。全部组织均经10%福尔马林固定,石蜡包埋,术前未经放疗、化疗。采用原位杂交方法检测Survivin mRNA、Caspase-3 mRNA的表达;采用免疫组化方法检测Survivin与VEGF蛋白的表达;应用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液培养人舌鳞癌Tca8113细胞系,应用不同浓度的紫杉醇作用细胞,光镜观察培养细胞的形态变化,采用CCK-8检测细胞增殖的变化,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡的变化,RT-PCR检测Survivin mRNA的变化。所有资料采用SPSS13.0软件进行数据分析,计量资料用(?)±s表示,多组比较采用方差分析,用LSD法进行两两比较;两组比较采用t检验;计数资料采用x~2检验和Fisher‘s精确概率法,Spearman等级相关检验,取α=0.05为显著性检验水准。 结果 1、Survivin mRNA在舌鳞癌组织中阳性表达率为55.6%,正常舌组织中未见Survivin mRNA的染色,两组之间有非常显著的统计学差异(P<0.01)。在高分化、中分化、低分化TSCC中,Survivin mRNA阳性表达率分别为38.5%、50.0%、83.3%,其中高分化组与低分化组间差异有统计学意义(P<0.05)。在TNM分期中,Ⅲ、Ⅳ组和Ⅰ、Ⅱ组Survivin mRNA的阳性表达率分别为75.0%、33.3%,两组之间差异有显著的统计学意义(P<0.01)。伴颈淋巴结转移的TSCC组织中Survivin mRNA阳性表达率为81.3%,明显高于未伴颈淋巴结转移者41.4%(P<0.05)。Survivin mRNA的表达与TSCC患者的性别、年龄之间无统计学差异(P>0.05)。 2、正常舌组织中Caspase-3 mRNA的阳性表达率为80.0%,在舌鳞癌组织中的阳性表达率为42.2%,二组之间有显著的统计学差异(P<0.05)。在高分化、中分化、低分化TSCC中,Caspase-3 mRNA阳性表达率分别为61.5%%、45.0%、16.7%,其中高分化组与低分化组间差异有统计学意义(P<0.05)。在临床TNM分期中,Ⅲ、Ⅳ组中Caspase-3 mRNA的阳性表达率为16.7%,Ⅰ、Ⅱ组中为76.2%,二组之间的差异有统计学意义(P<0.01)。伴颈淋巴结转移的TSCC中Caspase-3 mRNA的阳性率为18.8%,未伴颈淋巴结转移的为55.2%,二者之间有统计学差异(P<0.05)。Caspase-3 mRNA的表达与TSCC患者的性别、年龄之间无统计学意义(P>0.05)。 3、在25例Survivin mRNA阳性表达的舌鳞癌中,有6例Caspase-3 mRNA表达阳性,占24.0%,在20例Survivin mRNA阴性表达的舌鳞癌中,有13例Caspase-3 mRNA表达阳性,占65.0%。经相关分析,两者之间成负相关,Spearman相关系数,r=-0.412。 4、Survivin蛋白在舌鳞癌组织中阳性表达率为68.9%,正常舌组织中未见Survivin的染色,两组之间有非常显著的统计学差异(P<0.01)。在高分化、中分化、低分化TSCC中,Survivin阳性表达率分别为46.2%、70.0%、91.7%,高分化组与低分化组间差异有统计学意义(P<0.05)。Ⅲ、Ⅳ组和Ⅰ、Ⅱ组Survivin的阳性表达率分别为83.3%、52.4%,两组之间差异有统计学意义(P<0.05)。伴颈淋巴结转移的TSCC组织中Survivin阳性表达率为93.8%,明显高于未伴颈淋巴结转移者55.2%(P<0.01)。Survivin的表达与TSCC患者的性别、年龄之间无统计学差异(P>0.05)。 5、VEGF蛋白在舌鳞癌组织中阳性表达率为64.4%,正常舌组织中未见VEGF的染色,两组之间有非常显著的统计学差异(P<0.01)。Ⅲ、Ⅳ组和Ⅰ、Ⅱ组VEGF的阳性表达率分别为79.2%、47.6%,两组之间差异有统计学意义(P<0.05)。伴颈淋巴结转移的TSCC组织中VEGF阳性表达率为87.5%,明显高于未伴颈淋巴结转移者51.7%(P<0.05)。VEGF的表达与TSCC的分化程度及患者的性别、年龄之间无统计学差异(P>0.05)。 6、在31例Survivin阳性表达的舌鳞癌中,有24例VEGF表达阳性,占77.4%,在14例Survivin阴性表达的舌鳞癌中,有5例VEGF表达阳性,占35.7%。经相关分析,两者之间成正相关,Spearman相关系数r=0.403。 7、经过不同浓度的紫杉醇作用后,Tca8113细胞的增殖能力受到明显抑制,抑制率具有浓度及时间依赖性。0.1μmol/L紫杉醇作用48小时后,G2/M期细胞比例占41.68±5.93%,与对照组及其他两组相比有统计学差异(P<0.01);0.1μmol/L紫杉醇作用于舌癌细胞12、24、48小时后,舌癌细胞的凋亡率分别为1.45±0.21%、3.59±0.42%、7.83±1.03%,与对照组相比有显著性差异(P<0.01)。0.1μmol/L紫杉醇作用12小时后,Survivin mRNA增加,高于对照组,作用24小时后Survivin mRNA开始减少,48小时明显减少。 结论 1、Survivin mRNA在舌鳞癌中高表达与肿瘤的发生、发展有密切关系,可能与抑制Caspase-3 mRNA的表达有关。 2、舌鳞癌中Survivin和VEGF蛋白的高表达在舌鳞癌的发生、发展、转移及肿瘤血管生成中具有协同作用。 3、紫杉醇可能通过抑制Survivin mRNA诱导舌鳞癌细胞系Tca8113的凋亡。
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R739.86

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