收藏本站
《中国医科大学》 2007年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

硫酸软骨素减轻实验性急性坏死性胰腺炎胰腺腺泡细胞损伤机制的研究

何忠野  
【摘要】: 前言 众多研究表明:在急性胰腺炎(Acute Pancreatitis,AP)发生、发展中产生了大量活性氧及自由基(Reactive Oxygen Species,ROS),同时伴有内源性抗氧化剂消耗从而引起了氧化应激损伤。 在AP早期有两个具有特征性的病理、生理事件:其一为actin细胞骨架变化;其二为细胞间隙迅速扩大,此时富含蛋白的细胞外液流入,这反映了胰腺水肿的共有现象。腺泡细胞中F-actin排列紊乱,肌动蛋白细胞骨架的基本组成蛋白改变是细胞骨架变化进而干扰酶原分泌及细胞功能的原因。含微丝的actin负责细胞的张力性延伸并参与细胞黏附分子复合体的形成。胰腺细胞这一细胞间粘连对于维持腺细胞极性及细胞间隙、防止酶原颗粒进入胰腺间质具有重要意义。黏附分子复合体主要分子是钙依赖性细胞黏附蛋白或钙粘素,对于上皮细胞最主要的是E-cadherin。在AP时E-连接复合体解聚、E-cadherin重新分布于胞浆并引起了细胞间连接破坏、细胞间隙扩大。 小热休克蛋白27(HSP27)是actin聚合的磷酸化依赖性调控子,HSP27极有可能参与了AP过程中细胞骨架的调控,而HSP27及其他HSPs可由细胞应激诱导,其数量及磷酸化程度可能对AP的结局有影响。HSP27磷酸化是由独特信号传导通路调节的包括:P38 MAPK及MAPK活化激酶2/3。actin调控及谷胱甘肽保护均源于HSP27的保护作用。HSP27磷酸化可以消除阻碍F-actin积聚的作用并引起细胞骨架变化。故而推测HSP27及其他HSPs如HSP70等蛋白表达及磷酸化升高可对细胞结构完整性起到保护作用。 氨基葡聚糖(Glycosaminoglycans,GAGs)是一个大的异质多糖家族,是置涣性硫酸多聚体(除透明质酸,HYA),由转化的己糖醛酸组成(除硫酸角质素,KS)。己糖胺单位,在所有活体器官中有重要作用,它们的结构和异质程度具高度特异性。一些蛋白具有与GAGs的结合能力,可能反应出功能性关联或许也揭示了它们以多种不同方式而进行的不同的生理功用。GAGs存在于血中,正常人血中主要的GAGs是软骨素-4-硫酸(C4S),为低硫酸形式。近期有诸多文献报道了GAGs,特别是C4S在各种体内/外实验性模型中具有抗氧化作用。生物化学、细胞学、生物学的发展揭示出GAGs不仅只是细胞外基质的组成,而且调控一些细胞事件和生理过程。从生理学角度解释了在AP及其他疾病中GAGs增加的原因。事实上,GAGs升高可能是对抗自由基产生的生物反应。 硫酸软骨素可缓解抗氧化剂消耗及胰腺损伤,但GAGs对AP时胰腺细胞骨架、细胞连接等与AP关系密切的细胞变化的影响,尚未见研究报道。本研究分三部分 论文一 硫酸软骨素腹腔注射预处理对大鼠急性坏死性胰腺炎胰腺细胞的保护作用 方法 雄性Wistar大鼠(n=90)。随机分为3组:A组,急性坏死性胰腺炎组;B组,硫酸软骨素处理组;C组,假手术组,仅翻动胰腺。动物模型采用Aho等的方法。腹腔注射10%水合氯醛麻醉动物后剖腹,在手术显微镜下进行牛磺胆酸钠胆胰管逆行注射。B组动物在ANP诱导前1h,腹腔注射硫酸软骨素(30mg/kg),A、C组以等量盐水代替。各组动物分别在30′、1、3、6、12h处死,取腹主动脉血测定SAM。切取12指肠窗内胰腺组织测定MDA、GSH、SOD和ATP含量。在胰尾部组织中迅速切取1mm~3小块固定于2%戊二醛固定液中送电镜检查。其余部分以中性甲醛固定做HE染色进行病理评分。以TAB比色法测定MDA;以亚硝酸盐形成法测定SOD;以Beutler改良法测定GSH;用色谱法测定ATP含量。观察胰腺组织的病理学变化(包括大体组织形态、光镜及电镜下的病理变化)。 结果 A、B两组均有SAM水平的升高,病理组织学上有相应的ANP变化。同一时点比较发现:A组胰腺组织中GSH、SOD、ATP明显下降(P<0.05)、MDA明显升高(P<0.05);B组则GSH、SOD、ATP下降幅度较小,与A组比较差异有显著性(P<0.05),MDA升高幅度小,与A组比较差异有显著性(P<0.05)。 结论 ANP时胰腺组织中内源性抗氧化物质显著下降,脂质过氧化增加。有明显的氧化应激损伤,硫酸软骨素腹腔注射预处理可作为氧自由基清除剂明显减轻ANP大鼠胰腺细胞损伤。 论文二 硫酸软骨素腹腔注射对ANP大鼠胰腺细胞间连接和F-actin细胞骨架的稳定作用 方法 雄性Wistar大鼠(n=90),随机分三组:A组为急性坏死性胰腺炎模型组(ANP)(5%牛磺胆酸钠逆行胰管注射);B组为硫酸软骨素处理组;C组为假手术组。三组动物分别于30′、1h、3h、6h、12h处死。检测胰腺系数(胰湿重/鼠体重×100%);透射电镜观察细胞间连接的变化;在激光共聚焦显微镜下观察粘合连接蛋白—E-钙粘素(E-cadherin)在细胞内分布、定位的变化;western-blot进行E-cadherin蛋白半定量检测及RT-PCR显示其mRNA的变化趋势。以罗丹明—法罗丁进行F-actin染色,在共聚焦激光显微镜下观察并采集图象、荧光值分析。胰腺的HSP27组化染色,应用HSP27和HSP27磷酸化抗体进行western-blotting半定量分析HSP27蛋白及其磷酸化蛋白的含量。应用RT-PCR方法半定量分析HSP27 mRNA表达。 结果 A组胰腺系数迅速升高并持续增长,间质水肿严重(P<0.05),细胞间连接损伤,E-cadherin弥漫分布于胞浆内,western-blot及RT-PCR结果显示E-cadherin蛋白含量持续下降(P<0.05)而其mRNA水平明显升高(P<0.05);在B组中发现间质水肿比A组差(P<0.05),细胞连接稳定,虽E-cadherin在细胞内分布、定位紊乱,但其蛋白水平明显高于A组(P<0.05),而mRNA水平与A组无明显差异(P>0.05)。实验性急性胰腺炎早期就存在细胞骨架的急剧变化和F-actin含量降低。硫酸软骨素引起了HSP27蛋白、HSP27磷酸化蛋白及其mRNA表达水平升高,缓解了actin细胞骨架的损伤。 结论 在牛磺胆酸钠诱导的实验性ANP早期,存在细胞粘合蛋白—E-cadherin的降解,胰腺细胞连接解体从而引起胰腺水肿,以及细胞骨架的剧烈变化,F-actin分布紊乱、含量降低。同时伴随有HSP27蛋白、HSP27磷酸化蛋白、mRNA表达升高。HSP27在结构较好的腺泡细胞中高表达说明,HSP27可能具有保护作用。硫酸软骨素(CS)作为氨基葡聚糖家族(GAGs)主要成员之一,通过缓解稳定了细胞连接从而减轻了胰腺水肿。同时,硫酸软骨素增高了HSP27的应激表达缓解了细胞骨架损伤。硫酸软骨素引起的HSP27表达升高可能源于它的细胞保护作用从而减少了蛋白损伤。另外,基因表达增高也可能参与了这一作用。 论文三 硫酸软骨素增加HSP27蛋白及其磷酸化表达减轻离体胰腺细胞骨架损伤的机制 方法 细胞提纯时采用了一种改良的方法,取健康的雄性Wistar大鼠10只,体重200-250克,以乙醚吸入方法麻醉动物后浸于75%乙醇中消毒。无菌条件下,于超净工作台上,在手术显微镜下,经胆胰管汇合处穿刺缓慢逆行注入细胞分离液(2mg/mL浓度的Ⅰ型胶原酶,3-5mL),然后迅速切取胰腺,将胰腺组织剪碎为约1-3mm~3小块后,加入预热的细胞分离液,在37℃水浴箱中搅动120rpm消化10分钟。经过过滤、离心,提取胰腺腺泡细胞的单细胞悬液并收集细胞放于CO_2孵箱内(37℃,5%CO_2)。细胞计数:吸取少量细胞悬液,加到细胞计数板上,在倒置显微镜下(10×物镜)计数细胞数目。细胞活性测定(台盼蓝排斥实验):计数活细胞和死细胞数目,计算细胞活性率。腺泡细胞纯化率鉴定:将细胞悬液调整到10~5-10~6个/mL浓度后,在离心涂片仪上进行细胞离心涂片(1000rpm,10分钟)制成细胞切片,分别给予HE染色和酶原颗粒的亚甲蓝特殊染色,计算出腺泡细胞纯化率。 细胞分离后随机分为三组:ANP组(A组);ANP+硫酸软骨素组(B组);对照组(C组)。在B组中细胞悬液与4%的硫酸软骨素预孵30分钟后,以0.2%牛磺胆酸钠分别处理30分钟、1小时、3小时。但A组和C组仅给予等量生理盐水预孵,并且在C组中仅给予等量生理盐水代替牛磺胆酸钠进行细胞处理。以罗丹明—法罗丁进行F-actin染色,在共聚焦激光显微镜下观察并采集图象,以流式细胞仪进行细胞F-actin含量测定。应用HSP27和HSP27磷酸化蛋白(Ser15、86)抗体进行western-blotting半定量分析HSP27和HSP27磷酸化蛋白含量。应用RT-PCR方法半定量分析HSP27 mRNA表达。 结果 在倒置显微镜下计数细胞数目,按公式计算:细胞数目=(4大格细胞数之和/4)×10~4×细胞原液量(mL)得出平均每只大鼠可提取细胞数目为4.7±0.6×10~6个细胞与文献报道无统计学差异。细胞活性率:台盼蓝排斥实验,蓝染者为死细胞,计算活细胞率为91±7%,符合文献报道。腺泡细胞纯化率:分别计数10个高倍视野的HE切片上的细胞数和亚甲蓝特殊染色切片上的细胞数,计算出腺泡细胞纯化率。不同文献报道的腺泡细胞纯化率从40-60%到80-90%差异较大,本实验中得到的腺泡细胞纯化率为70-80%。 牛磺胆酸钠处理离体胰腺细胞后,早期就存在细胞骨架的急剧变化和F-actin含量降低。硫酸软骨素缓解了actin细胞骨架的损伤,引起了HSP27、HSP27磷酸化蛋白及其mRNA表达水平升高。 结论 本实验中的改良方法具有耗酶量少、技术难度小的特点,是一种简易、经济的大鼠胰腺腺泡细胞分离、纯化的方法。可以直接制备单细胞悬液,更加便于施加处理因素,并有利于进行western-blotting,RT-PCR等电泳实验。非常适合于急性胰腺炎早期(12小时内)胰腺腺泡细胞病理、生理变化的研究。 牛磺胆酸钠诱导的离体胰腺细胞损伤早期就有细胞骨架的剧烈变化,F-actin分布紊乱、含量降低。同时伴随有HSP27、HSP27磷酸化蛋白和mRNA表达升高。硫酸软骨素进一步增高了HSP27及其mRNA的表达水平缓解了细胞骨架损伤。
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R576

【参考文献】
中国期刊全文数据库 前4条
1 张桦,蔡德鸿,徐春生,陈宏,刘宏;一种简易高效的大鼠胰岛分离纯化方法[J];第一军医大学学报;2001年02期
2 杨亚龙;肌动蛋白的聚合[J];生物学杂志;1995年03期
3 余欢明,陈秋强;E钙粘蛋白与肿瘤的关系[J];医师进修杂志;2003年16期
4 宋力,黄巧冰,赵克森;蛋白激酶C与内皮细胞骨架蛋白和血管通透性研究进展[J];中国微循环;2003年03期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 许玲,刘龙,孙大志,魏品康;E-钙粘蛋白与胃癌中医证型关系的研究[J];成都中医药大学学报;2004年04期
2 任双义;杨春明;;生长抑素5-氟脲嘧啶和雷尼替叮对急性出血性坏死性胰腺炎治疗作用的实验研究[J];大连医学院学报;1993年01期
3 廖鹏;程远;;热休克蛋白B1在U251细胞株及其干细胞中的差异性表达对肿瘤细胞凋亡的影响[J];第三军医大学学报;2011年20期
4 杨芬;万琪;;短期学习记忆对小鼠脑组织内热休克蛋白表达的影响[J];第四军医大学学报;2005年24期
5 王连才;马清涌;陈香丽;;一种改进的简便经济的大鼠胰腺腺泡细胞分离提纯方法[J];第四军医大学学报;2008年03期
6 郭南京;孙嘉;陈宏;徐艳花;高飞;张桦;张振;蔡德鸿;;利拉鲁肽对糖耐量异常OLETF大鼠胰岛白细胞介素-1β表达的影响[J];南方医科大学学报;2012年06期
7 张振;陈宏;张桦;王敏;刘敏;李明;蔡德鸿;;供体凋亡细胞输注对大鼠胰岛移植物功能的影响[J];广东医学;2008年01期
8 熊刚;黄志勇;张军;王武军;;食管鳞状细胞癌与癌旁组织蛋白表达谱的差异[J];广东医学;2008年05期
9 程书榜,王成友,徐敏;温生理盐水持续腹腔灌洗预处理对大鼠急性胰腺炎的影响[J];肝胆外科杂志;2003年01期
10 ;Effects of chondroitin sulfate on alteration of actin cytoskeleton in rats with acute necrotizing pancreatitis[J];Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International;2007年05期
中国重要会议论文全文数据库 前1条
1 盛士虎;张宁宁;黎炽彬;陈丹;燕王翔;丁学强;王安训;;HSP27在舌白斑中的表达及意义[A];第八次全国口腔颌面—头颈肿瘤会议论文汇编[C];2009年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 闻真珍;硫矿硫化叶菌小热激蛋白SsHSP14.1的功能特性研究[D];华南理工大学;2010年
2 孙学成;Obestatin对大鼠胰腺外分泌调节作用的实验研究[D];第二军医大学;2011年
3 王绍祥;新型Hsp90抑制剂SNX-2112的抗肿瘤作用及机制[D];暨南大学;2011年
4 曹中赞;人工感染传染性支气管炎病毒鸡气管和肾脏的蛋白质组学分析[D];中国农业科学院;2011年
5 李月花;HSP72对大鼠青光眼模型视网膜神经节细胞和外侧膝状体神经元损伤的保护作用[D];中南大学;2011年
6 陈璋辉;前列腺癌相关融合基因TMPRSS2-ERG及循环microRNA的研究[D];浙江大学;2011年
7 龚加庆;干细胞参与胰腺炎损伤修复实验研究[D];第三军医大学;2011年
8 张淼;应激过程中组织和细胞内HSPs表达与应激性损伤机理研究[D];南京农业大学;2011年
9 贾晓晶;帕金森氏病体外细胞模型的建立及胞二磷胆碱对多巴胺能神经元保护作用的研究[D];吉林大学;2004年
10 施新岗;MAPK信号转导通路在重症急性胰腺炎发病机制中的作用[D];第二军医大学;2004年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 张永梅;脂氧素A_4对CTGF和TGF-β_1诱导的人肾小管上皮细胞转分化的影响[D];南京医科大学;2009年
2 张霞;小鼠心肌特异性高表达Hsp27诱导还原应激及心肌病[D];南京医科大学;2010年
3 谷明波;乳腺癌中Hsp27功能研究[D];浙江理工大学;2010年
4 孙鹏;CD147与HSP27在口腔鳞癌中的表达及意义[D];吉林大学;2011年
5 孙超;烧伤后SD大鼠脑组织HSP27表达和细胞凋亡变化及EPO干预的影响[D];昆明医学院;2011年
6 徐皓;化疗后不同时期胶质瘤组织中应激反应相关基因、热休克蛋白基因和细胞增殖相关基因的表达及其关系的探索性研究[D];福建医科大学;2011年
7 郭琼梅;大鼠肾缺血后处理对热休克蛋白表达的影响及作用[D];河北医科大学;2011年
8 程春;人参皂苷Rh_2对人肝癌细胞株SMMC-7721诱导分化实验性研究[D];南通大学;2010年
9 李荣;HSP22在心肌缺血再灌注损伤中的保护作用[D];中南大学;2011年
10 葛全兴;一种简便高效的大鼠胰腺腺泡细胞的体外分离培养方法及其对细胞功能的影响[D];广东药学院;2010年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前1条
1 周茂华,陈东明,唐军民,夏兆骥;大鼠胰岛移植物制备与异种移植[J];中华器官移植杂志;1998年04期
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 邓力珲;夏庆;;急性胰腺炎的腺泡细胞钙超载发病机制及其研究方法[J];胰腺病学;2006年05期
2 殷浩;沈柏用;邓侠兴;程东峰;彭承宏;;腹腔镜胰体尾联合脾切除治疗胰腺腺泡细胞癌1例[J];中国实用外科杂志;2009年02期
3 邓力珲;夏庆;;急性胰腺炎腺泡细胞钙超载发病机制及其研究方法[J];胃肠病学;2006年02期
4 刘忠;关凤林;沈忠义;胡祥;陈海龙;尚东;;胰腺腺泡细胞凋亡在大鼠胰腺移植急性排斥反应中的作用[J];肝胆外科杂志;2006年03期
5 马晶晶;王兴鹏;吴恺;黄晓曦;徐铭益;曾悦;;高三酰甘油血症对大鼠胰腺腺泡细胞的影响[J];胰腺病学;2006年05期
6 潘国宗;陈敏章;;离体胰腺腺泡的制备及应用[J];国外医学.内科学分册;1983年05期
7 沈骥,吴宗平,肖华,浦青凡,宋永慧,刘旻,阎新林,黄建民,严律南;异搏定对胰腺腺泡细胞内游离钙离子浓度的影响[J];中华实验外科杂志;1997年04期
8 郑海,陈道达,张景辉,田园,朱鹏;高浓度的卡巴胆碱体外诱导鼠胰腺腺泡细胞NF-κB活化[J];腹部外科;2004年02期
9 梁桃;马占军;尚国印;史立军;;急性胰腺炎胰腺腺泡细胞凋亡对大鼠腹腔巨噬细胞功能影响的研究[J];中国康复;2009年03期
10 张红;李永渝;;维拉帕米减轻脂多糖导致的大鼠胰腺腺泡细胞损伤机制的研究[J];中国病理生理杂志;2007年03期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 黄刚;汤为学;陶小红;;生长抑素对急性胰腺炎治疗机制的初步研究[A];第九次全国消化系统疾病学术会议专题报告论文集[C];2009年
2 韩宗强;张双凤;李婷婷;梁慧媛;崔宗杰;;甲硫氨酸亚砜还原酶与大鼠胰腺腺泡细胞CCK1型受体的氧化激活[A];第七届全国光生物学学术会议论文摘要集[C];2010年
3 沈筠;赵晓婷;崔宗杰;;大鼠胰腺腺泡细胞中TRP通道的表达及其功能[A];第十一次中国生物物理学术大会暨第九届全国会员代表大会摘要集[C];2009年
4 石怀银;韦立新;李向红;笪冀平;;胰腺腺泡细胞癌14例临床病理分析[A];中华医学会病理学分会2005年学术年会论文汇编[C];2005年
5 蔡佳;罗和生;;生长抑素受体在胰腺腺泡细胞上的表达及其功能受体亚型[A];中华医学会第七次全国消化病学术会议论文汇编(上册)[C];2007年
6 郑海;蒋春舫;刘苏南;陈阳龙;方开峰;陈庆永;;高浓度M3型胆碱能受体激动剂卡巴胆碱体外诱导鼠胰腺腺泡细胞内胰蛋白酶原激活和NF-kB活化的关系[A];第四届全国灾害医学学术会议暨第二届“华森杯”灾害医学优秀学术论文评审会学术论文集[C];2007年
7 王碧珏;崔宗杰;;CCK能而非胆碱能刺激激活NADPH氧化酶升高胞内ROS浓度引起禽类胰腺腺泡细胞凋亡[A];第十次中国生物物理学术大会论文摘要集[C];2006年
8 王南;刘媛;谢孟侠;崔宗杰;;光动力作用改变大鼠胰腺腺泡细胞质膜蛋白的二级结构[A];中国细胞生物学学会2005年学术大会、青年学术研讨会论文摘要集[C];2005年
9 那顺布和;崔宗杰;;胰腺炎发生早期CCK1型受体的不可逆激活揭示白细胞侵润及呼吸爆发在胰腺炎启动中的关键作用[A];第十次中国生物物理学术大会论文摘要集[C];2006年
10 马晶晶;王兴鹏;黄晓曦;;高甘油三酯血症对大鼠胰腺腺泡细胞凋亡的影响[A];中华医学会第七次全国消化病学术会议论文汇编(上册)[C];2007年
中国重要报纸全文数据库 前1条
1 陈汉桥;大连提出急性胰腺炎细胞凋亡新论[N];中国医药报;2001年
中国博士学位论文全文数据库 前9条
1 唐曦平;靶向干扰ghrelin基因对急性胰腺炎胰腺腺泡细胞炎症与钙通路的调节机制研究[D];广西医科大学;2013年
2 周旭春;环氧合酶-2与胰腺癌、酒精性胰腺腺泡细胞退行性变[D];重庆医科大学;2003年
3 程宇星;大柴胡汤治疗急性胰腺炎对胰腺腺泡细胞线粒体蛋白质的影响[D];广州中医药大学;2008年
4 曾悦;内质网应激通路在高甘油三酯血症合并急性胰腺炎大鼠发病中的作用[D];复旦大学;2007年
5 张红;脂多糖、去氧胆酸钠对大鼠胰腺腺泡细胞的损伤作用和粉防己碱的防治效应及机制的实验研究[D];天津医科大学;2003年
6 程锐;长链Omega-3多不饱和脂肪酸对重症急性胰腺炎的调节作用及其机制的实验研究[D];华中科技大学;2010年
7 邵宏伟;抗癌中药有效成分诱导胰腺泡细胞凋亡治疗急性胰腺腺炎的可行性及机理研究[D];天津医科大学;2002年
8 赵佳正;P物质和硫化氢在评价急性胰腺炎严重程度中的作用[D];中南大学;2012年
9 陈辰;罗格列酮对大鼠急性胰腺炎肺损伤的作用及其机制探讨[D];武汉大学;2009年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 葛全兴;一种简便高效的大鼠胰腺腺泡细胞的体外分离培养方法及其对细胞功能的影响[D];广东药学院;2010年
2 彭爽;钙信号调节物在胰腺腺泡细胞中的保护作用[D];暨南大学;2013年
3 陈婧华;促红细胞生成素对大鼠胰腺腺泡细胞和肺组织的保护作用[D];广东药学院;2011年
4 王俊;HMGB1对急性重症胰腺炎大鼠胰腺腺泡细胞死亡方式影响的研究[D];遵义医学院;2011年
5 白亮;大鼠胰腺腺泡细胞TAP与HMGB1表达的相关性[D];遵义医学院;2010年
6 王国良;HMGB1诱导大鼠胰腺腺泡细胞JAK2/STAT3信号通路活化的研究[D];遵义医学院;2013年
7 黄刚;生长抑素对急性胰腺炎治疗机制的初步研究[D];重庆医科大学;2010年
8 汤茂春;塞来昔布对大鼠胰腺腺泡细胞炎症损伤的影响[D];上海交通大学;2008年
9 付兰英;H_2S通过PI_3K/AKT-NF-κB通路调节离体大鼠胰腺腺泡细胞TNF-α、IL-1β、IL-10的表达[D];第三军医大学;2013年
10 王文;亚低温对雨蛙肽致大鼠胰腺腺泡细胞损伤的保护作用[D];苏州大学;2008年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026