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~(99)Tc~m-rh-Annexin V检测肿瘤细胞凋亡的实验研究

张欣  
【摘要】: 前言 肿瘤的发生主要是由于细胞变异所导致,细胞过度增殖的失控及细胞凋亡过程被压抑均会诱导肿瘤的发生。例如,凋亡诱导蛋白能力的变异及P53蛋白功能的丧失,在肿瘤基因学中起到很重要的作用。肿瘤对于治疗的敏感程度通常是通过最初的细胞凋亡途径表现出来;许多抗肿瘤药物的治疗效果是作用于干扰DNA的合成及细胞的分裂,从而在目标瘤体内诱导产生凋亡,达到治疗的目的。因此,可以依据在治疗后肿瘤内诱导产生凋亡的程度来早期评价肿瘤的治疗效果,并有望依此及时调整治疗计划,制定针对于每一位患者本人的个体化的、最佳的治疗方案。 在细胞凋亡的早期,位于细胞膜内层的PS(磷脂酰丝氨酸)作为一种特异性的改变翻转并暴露于细胞膜的外表面,在钙离子的存在下,人体内源性蛋白——膜联蛋白V(Annexin V)能够与细胞膜上的PS紧密结合。放射性核素~(99)Tc~m标记的Annexin V类示踪剂,与体内生理性的Annexin V具有相似的生物学特征,同样能够与暴露于凋亡细胞胞膜表面的PS紧密结合。近年来,放射性核素标记的Annexin V显像技术已应用于体内细胞凋亡的检测之中;本研究的目的在于验证应用~(99)Tc~m-rh-AnnexinV显像检测放、化疗后早期肿瘤细胞凋亡的可行性。 试验材料 一、实验动物 选择体重为17-24克的健康纯系615小鼠,由大连医科大学实验动物中心提供。小鼠肝癌细胞株(Hca-F25)由大连医科大学附属二院中心实验室提供。 二、试验药品 重组(人)膜联蛋白V(rh-Annexin V);高锝酸盐(~(99)Tc~mO_4~-);Annexin V—FITC(异硫氰酸荧光素)/碘化丙啶(PI)试剂盒(论文一);TUNEL(碱磷酶染色)检测试剂盒;Bcl-2/Bax免疫组化试剂盒(论文二);Survivin、Caspase-3免疫组化试剂盒(论文三)。 三、试验仪器 井型闪烁探测器内(北京261厂);美国GE Hawkeye双探头SPECT,配备低能高分辨平行孔准直器;FACS VANTAGE流式细胞仪(BD公司);医用直线加速器(VARIAN—2300 C/D);透射电镜(日本电子株式会社JEM—2000EX);Olympus光学显微镜;美国RMAZEPRO—PLUS4.5图像分析软件。 试验方法 一、实验动物分组 将实验动物分为体内分布组及荷瘤实验组。体内分布组:18只,按注入显像剂(~(99)Tc~m-rh-Annexin V)后不同时间随机分为6个小组,每小组3只。将荷瘤实验组小鼠(41只)随机分为A(化疗组,13只)、B(放疗组,10只)、C(对照组,12只)、D(空白对照组,6只)4组。将A、C组按不同显像时间各分为三个亚组(A1,1h,n=3;A2,4h,n=4;A3,6h,n=6;C1,1h,n=3;C2,4h,n=4;C3,6h,n=5);B组按不同照射剂量分为3个亚组(B1,2Gy,n=4;B2,5Gy,n=3;B3,10Gy,n=3);将D组分为2个亚组(D1,n=3;D2,n=3)。 二、动物模型制备 (一)肿瘤模型制备 将小鼠肝癌细胞(Hca-F25)制备成单细胞悬液(1×10~6/0.1ml),接种于小鼠右腋下部位。8天后,肿瘤生长至直径约1cm时备用实验。 (二)化疗 化疗组一次性接受环磷酰胺(cyclophosphamide)腹膜内注射,剂量为150mg/kg,对照组腹膜内注射同等体积生理盐水;20h后,A、C两组同时注入~(99)Tc~m-rh-Annexin V(0.1 ml)。 (三)放疗 放疗组各亚组肿瘤组织分别接受2Gy、5Gy、10Gy单次放射治疗(X射线,6MV,皮源距100cm,照射野1.75cm×1.75cm);放疗结束后1h由鼠尾静脉注入~(99)Tc~m-rh-Annexin V0.1ml。 (四)空白对照 D1组在接受相同剂量环磷酰胺化疗后,由鼠尾静脉注入未标记Annexin V的高锝酸盐及还原剂(体积均为0.1ml),D2组未接受化疗,同样由鼠尾静脉注入0.1ml高锝酸盐及还原剂。 三、凋亡细胞检测 (一)放射性示踪剂检测 应用SPECT及井型闪烁探测器观察不同时间示踪剂在小鼠体内的生理性分布状况,并计算不同器官每克组织百分注射剂量率(%ID/g);A、B、C、D各试验组按不同时间显像、处死、取材;比较各亚组间肿瘤组织的%ID/g、靶/本底比值(T/M、T/B) (二)流式细胞分析 采用流式细胞仪分析对照组、化疗组及放疗组凋亡细胞(Annexin V阳性/PI阴性)所占百分比。 (三)免疫组化分析 检测对照组、化疗组及放疗组TUNEL检测阳性细胞数以及Bcl-2、Bax、Survivin、Caspase-3蛋白表达。 结果 论文一 采用直接标记法标记的~(99)Tc~m-rh-Annexin V标记率大于98%;~(99)Tc~m-rh-Annexin V在肾脏中的生理性分布最高,肝脏中分布较少,而其它组织及脏器中分布则甚少。流式细胞检测结果显示,经放化疗诱导后小鼠肿瘤组织内凋亡细胞数量较对照组明显增加;井型闪烁探测器检测肿瘤组织内~(99)Tc~m-rh-Annexin V分布结果显示,经放化疗诱导后小鼠肿瘤组织内~(99)Tc~m-rh-Annexin V摄取较对照组明显增加(P均<0.01);在化疗组4h、6h两个亚组及放疗组中,~(99)Tc~m-rh-AnnexinV分布与凋亡细胞数量呈明显正相关(r=0.813,r=0.780;p<0.05)。 论文二 经放化疗诱导后的小鼠肿瘤组织内~(99)Tc~m-rh-Annexin V摄取较对照组明显增加,且与TUNEL检测阳性细胞数呈明显正相关(p<0.01);对照组肿瘤组织内Bcl-2、Bax蛋白表达及Bcl-2/Bax比值与肿瘤组织内~(99)Tc~m-rh-Annexin V分布及TUNEL阳性细胞数均无明确相关性。经放、化疗诱导后的肿瘤组织内,Bcl-2蛋白表达与~(99)Tc~m-rh-Annexin V分布及TUNEL阳性细胞数均无明确相关性,Bax蛋白表达与~(99)Tc~m-rh-Annexin V分布及TUNEL阳性细胞数均呈明显正相关;而Bcl-2/Bax与~(99)Tc~m-rh-Annexin V分布及TUNEL阳性细胞数均呈明显负相关(P均<0.05)。 论文三 经放、化疗诱导后小鼠肿瘤组织内~(99)Tc~m-rh-Annexin V摄取较对照组明显增加,且与TUNEL检测阳性细胞数呈明显正相关(p<0.01);经放化疗诱导后肿瘤组织内Caspase-3蛋白表达均明显高于对照组,Survivin蛋白表达则明显低于对照组,差异存在显著性(P均<0.01)。肿瘤组织内Survivin蛋白表达与Caspase-3蛋白表达呈明显负相关(P<0.01);肿瘤组织内Survivin蛋白表达与~(99)Tc~m-Annexin V分布及TUNEL阳性细胞数均呈明显负相关,而Caspase-3蛋白表达与~(99)Tc~m-Annexin V分布及TUNEL阳性细胞数均呈明显正相关(P均<0.05)。 结论 论文一: 1、采用直接标记法标记的~(99)Tc~m-rh-Annexin V标记率高、体外稳定性好;示踪剂在体内主要通过肾脏排泄,肺脏、肝脏、肠道内核素分布相对较少,有利于胸、腹部疾病的检测。 2、~(99)Tc~m-rh-Annexin V显像可以用于反映放、化疗后早期(瘤体质量无明显变化)肿瘤组织细胞凋亡的状况。 3、注射~(99)Tc~m-rh-Annexin V 4h~6h后,肿瘤组织内示踪剂分布稳定,T/M、T/B的比值较高,显像效果较好。 论文二: 1、在未经治疗的肿瘤组织内,Bcl-2、Bax蛋白表达及比值并不能反映肿瘤细胞的凋亡状态,肿瘤组织内~(99)Tc~m-rh-Annexin V分布与Bcl-2、Bax蛋白表达及比值均无明确相关性。 2、经放、化疗诱导后,肿瘤组织内Bax蛋白表达明显升高,Bcl-2蛋白表无明显变化,Bcl-2/Bax比值下降,但肿瘤治疗前、后Bax表达与Bcl-2表达本身并无明确相关性。 3、经放、化疗诱导后,肿瘤组织内~(99)Tc~m-rh-Annexin V分布与Bax蛋白表达呈明显正相关,与Bcl-2/Bax比值呈明显负相关。 论文三: 1、经放、化疗诱导后肿瘤组织内~(99)Tc~m-Annexin V分布、TUNEL检测阳性细胞数及Caspase-3蛋白表达均明显多于对照组;Survivin蛋白表达对照组明显高于治疗组组,差异存在显著性。 2、无论治疗与否,小鼠肝癌组织内Survivin蛋白表达与Caspase-3蛋白表达均呈明显负相关。 3、无论治疗与否,肿瘤组织内~(99)Tc~m-rh-Annexin V分布与Caspase-3蛋白表达呈明显正相关,与Survivin蛋白呈明显负相关。


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