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组织工程化骨修复兔下颌骨缺损同期种植体植入的实验研究

王程越  
【摘要】: 前言 临床上对各种原因引起的伴有牙齿缺失的较大范围颌骨缺损患者进行快速有效的功能性修复,即在修复颌骨缺损的同时完成种植体的Ⅰ期植入,以缩短患者缺牙时间、减轻患者多次手术的痛苦,尽早完成咬合、咀嚼、吞咽、发音等功能的修复,是口腔颌面外科、口腔种植科以及口腔修复科医生所共同面对的一个难题。近年来组织工程学得到了快速的发展,其中以种子细胞、支架材料、生长因子为核心内容的骨组织工程技术,通过体外构建细胞——支架复合体,即组织工程化骨,用于替代自体骨、异体骨、异种骨被认为是最具潜力和发展前途的骨缺损修复材料。为提高颌骨缺损修复同期种植体植入的成功率,除需选择理想的骨缺损修复材料之外,种植体表面特性也起到了重要作用。为此,本课题尝试着以骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)为种子细胞、纳米羟基磷灰石/胶原(nano-hydroxyapatite/collagen,nHAC)为支架材料、富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)为生长因子来源,于体外构建组织工程化骨用于修复兔下颌骨缺损,并于其中同期植入表面喷砂酸蚀处理的钛种植体(sandblasted and acid-etched titanium,SLA-Ti)和表面喷砂酸蚀处理后羟基磷灰石涂层的钛种植体(hydroxyapatite/sandblasted and acid-etched titanium,HA/SLA-Ti),观察组织工程化骨修复骨缺损的能力及其负载的两种不同表面处理的种植体骨愈合能力的差别,具体内容分为以下五部分: 一、富血小板血浆对骨髓基质细胞生物学特性的影响 目的探讨自体PRP对体外培养的兔BMSCs生物学特性的影响。方法体外培养的兔BMSCs分为实验组和对照组,实验组中加入含1%PRP的DMEM条件培养基,对照组为不含PRP的DMEM培养基,在不同时间点收集两组细胞,分别进行形态学观察、细胞周期分布和增殖指数测定、碱性磷酸酶(ALP)染色和活性测定、骨钙素(OCN)含量测定以及骨桥蛋白基因(opn)mRNA相对表达量的分析。结果实验组细胞具有成骨细胞的形态学特征;PRP作用7d后S期细胞比例较对照组明显增加,细胞增殖指数由22.89±1.24增至33.15±1.02,具有统计学意义(P<0.01);实验组ALP染色呈阳性,且ALP活性、OCN含量均较对照组明显提高,差异具有统计学意义:opn mRNA相对表达量是对照组的3.48倍。结论PRP可促进兔BMSCs的增殖并可提高兔BMSCs的体外成骨潜能,使其向成骨细胞转化。 二、纳米羟基磷灰石/胶原对富血小板血浆促进骨髓基质细胞成骨向分化的影响 目的探讨nHAC作为支架材料对PRP体外诱导兔BMSCs向成骨细胞分化能力的影响。方法PRP分别作用于与nHAC联合培养的兔BMSCs及常规培养的兔BMSCs,利用扫描电镜观察兔BMSCs在nHAC上的生长情况;通过ALP活性测定、OCN含量测定以及opn mRNA相对表达量的分析,比较两种培养条件下PRP诱导兔BMSCs向成骨细胞分化能力上的差异。结果联合培养的兔BMSCs在nHAC上生长良好,其ALP活性、OCN含量均较常规培养明显增加,且opn mRNA相对表达量是常规培养组的4.78倍。结论nHAC作为支架材料可明显提高PRP诱导兔BMSCs向成骨细胞分化的能力。 三、钛种植体喷砂酸蚀表面羟基磷灰石涂层对骨髓源成骨细胞生物学特性的影响 目的探讨HA/SLA-Ti对骨髓源成骨细胞(marrow-origin osteoblasts,MOOBs)生物学特性的影响。方法应用离子束辅助沉积(ion beam assisted deposition,IBAD)技术在喷砂酸蚀(sandblasted and acid-etched,SLA)处理的钛种植体表面制备羟基磷灰石(hydroxyapatite,HA)涂层,将MOOBs分别接种于HA/SLA-Ti和SLA-Ti表面,观察其生长情况,并对两组MOOBs增殖指数、ALP活性、OCN含量以及opn mRNA相对表达量进行比较。结果MOOBs在HA/SLA-Ti表面生长良好,其细胞增殖指数、ALP活性以及OCN含量明显高于SLA-Ti组;且opn mRNA相对表达量是SLA-Ti组的3.25倍。结论应用IBAD技术在钛种植体SLA表面制备HA涂层,可明显促进MOOBs的增殖及其成骨表型的表达,是一种有应用前景的种植体表面处理方法。 四、组织工程化骨修复兔下颌骨缺损的实验研究 目的探讨以兔BMSCs为种子细胞、nHAC为支架材料、PRP为生长因子来源,于体外构建的组织工程化骨修复兔下颌骨缺损的能力。方法兔下颌骨体部范围为15mm×15mm的全层骨缺损分别采取相应方法修复:A组,组织工程化骨修复;B组,自体髂骨修复;C组,单纯nHAC材料修复;D组,空白对照组,缺损不做修复。分别于术后1、3、6个月取材,进行大体标本观察、放射性核素骨显像、骨密度测定及组织学观察。结果大体标本观察显示,术后A、B两组骨缺损区域逐渐由新生骨组织修复,C组骨缺损区域仅形成了类软骨样组织,D组无骨组织形成,骨缺损区域由纤维结缔组织充填;放射性核素骨显像结果显示,术后1个月、三个月时,A、B两组成骨代谢能力明显优于C组、D组,而A、B两组之间无显著差异,术后6个月时,各组之间骨代谢能力无明显差异;骨密度测定结果显示A、B、C三组骨缺损区域骨密度逐渐增加明显高于D组,术后3个月以后A组、B组骨密度较C组明显提高,而A、B两组之间无显著差异;组织学检查结果显示,A组在术后1个月时可见小片状类骨质出现,nHAC开始降解,术后3个月时新生骨成大片状结构,术后6个月时nHAC几乎全部降解,缺损由骨组织修复,其成骨量与B组无明显差异却明显大于C组,D组仅为纤维组织修复。结论组织工程化骨修复颌骨缺损能力与自体髂骨相似而强于单独使用nHAC,且nHAC材料于体内可完全降解,因此BMSCs与nHAC及PRP复合所构建的组织工程化骨是一种良好的骨缺损替代材料。 五、组织工程化骨修复兔下颌骨缺损同期不同表面处理的钛种植体植入的实验研究 目的观察组织工程化骨修复兔下颌骨缺损同期进行HA/SLA-Ti和SLA-Ti种植体植入后,种植体与周围新生骨组织发生骨整合的情况。方法兔BMSCs复合nHAC及PRP用于修复兔下颌骨颊侧范围为15mm×15mm的全层骨缺损,同期分别植入HA/SLA-Ti种植体(A组)和SLA-Ti种植体(B组)。术后1、3、6个月取材,进行大体标本观察、X线检查、扫描电镜观察、组织学检查及种植体的推入实验和拉出实验。结果大体标本观察显示,A组术区逐渐由新生骨组织修复,种植体周围形成完善的骨结合界面,界面骨成熟;B组术区骨愈合状态佳,但种植体周围仍存在少量纤维组织。X线检查结果显示,术后1个月A、B两组骨缺损区域骨密度较低,种植体周围大部分为X线透射影;术后3个月A、B两组骨缺损区域骨密度增加,与B组相比A组种植体周围有较多X线阻射影;术后6个月A组种植体周围为与正常骨组织密度相似的X线阻射影,B组种植体周围也为与宿主骨密度接近的X线阻射影,但密度并非均匀一致。扫描电镜结果显示,A组种植体较B组种植体与周围新生骨结合的更紧密。组织学检查的结果显示,A组新生骨与种植体表面直接结合,骨形成较B组种植体表面骨形成提前,B组种植体与新生骨之间存在纤维组织。推入实验和拉出实验结果显示,术后1个月时A、B两组种植体的推入应力和拉出负荷无明显差异,术后3个月后A组种植体的推入应力和拉出负荷明显较B组提高,差异具有统计学意义。结论修复兔下颌骨缺损的组织工程化骨内同期植入的种植体,可与新生的骨组织形成良好的骨结合,其中HA/SLA-Ti种植体的骨结合能力较SLA-Ti种植体强,且骨愈合时间也较后者提前。


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