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《中国医科大学》 2007年
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靶向Plk1的siRNA对肝癌细胞凋亡的影响

孙威  
【摘要】: 靶向PIk1的siRNA对肝癌细胞凋亡的影响 目的 检测肝细胞癌组织及肝癌细胞系中Plk1基因的表达情况,分析Plk1基因表达与肝细胞癌临床病理参数的关系,探讨Plk1基因在肝细胞癌中表达的意义。应用靶向Plk1的siRNA转染肝癌细胞系细胞,观察靶向Plk1的siRNA对肝癌细胞系细胞中Plk1基因表达及细胞凋亡的影响,探求靶向该基因的治疗在肝癌基因治疗中的可行性及效应,同时对靶向Plk1的siRNA促肝癌细胞凋亡的途径进行初步探讨。 材料和方法 应用免疫组化SP法检测肝细胞癌组织67例、配对癌旁肝硬化组织27例及正常肝组织5例中Plk1蛋白的表达情况,并分析Plk1蛋白的表达与临床病理参数之间的关系。Western Blot检测肝癌细胞系BCL-7402及HepG2细胞中Plk1蛋白的表达情况。设计合成两对靶向Plk1基因的双链siRNA核苷酸序列,分别命名为siRNA1和siRNA2,应用脂质体法将其转入BCL-7402细胞中。实验分为siRNA1、siRNA2、无关对照及空白对照4组。相同方法转染GFP质粒观察转染效率。RT-PCR检测转染24小时及48小时后各组细胞中Plk1 mRNA及p53mRNA表达的变化;Western Blot检测转染24小时及48小时后各组细胞中Plk1蛋白及p53蛋白表达的变化;流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡的改变;透射电镜观察细胞超微结构的变化。RT-PCR检测转染48小时后各组细胞中细胞凋亡相关基因bcl-2、bax、Caspase-8、Caspase-9及Caspase-3 mRNA表达情况。 结果 Plk1蛋白在肝癌组织中的阳性表达率为76.1%(51/67),其中强阳性44.8%(30/67)。在27例配对的癌旁肝硬化组织中Plk1蛋白均呈阳性表达,而5例正常肝组织中均无明显表达。高分化肝癌中Plk1蛋白的表达明显高于中低分化肝癌(P<0.01);无包膜侵犯的肝癌组织中Plk1蛋白的表达高于有包膜侵犯的肝癌组织(P<0.05);Plk1的表达与患者年龄、肿瘤直径、肿瘤数目、淋巴结转移、肝外转移、门静脉有无癌栓无关。肝癌细胞系BCL-7402及HepG2中均存在Plk1蛋白的过表达。应用靶向Plk1的siRNA转染肝癌细胞系BCL-7402细胞,转染24小时和48小时后,Plk1 mRNA相对水平siRNA1组分别较无关对照组和空白对照组下降了50%、51%和60%、62%,siRNA2组分别较无关对照组和空白对照组下降了42%、42%和54%、56%,siRNA1组、siRNA2组的Plk1 mRNA相对水平与无关对照组和空白对照组相比有显著统计学差异(P<0.01)。在转染24小时及48小时后,平均Plk1蛋白水平siRNA 1组分别较无关对照组和空白对照组下降了64%、65%和78%、81%,siRNA2组分别较无关对照组和空白对照组下降了50%、51%和60%、65%。siRNA 1组、siRNA2组中Plk1蛋白的表达与无关对照组和空白对照组相比有统计学差异(P<0.01)。p53基因的表达随着Plk1表达的抑制而明显增加(P<0.01)。转染24小时后,siRNA1组中4N DNA细胞数量明显增加,出现了G_2/M期细胞周期阻滞(P<0.01),但无大量凋亡细胞的出现。转染48小时后,siRNA1组中出现大量的凋亡细胞,与对照组相比有显著统计学差异(P<0.01),透射电镜下可见大量肝癌细胞凋亡早期及晚期形态学改变。在转染Plk1 siRNA1 48小时后,siRNA1组BCL-7402细胞中bcl-2 mRNA的表达明显减少,而bax mRNA的表达明显增加;Caspase-8 mRNA和Caspase-3 mRNA表达明显增加,与对照组相比有统计学差异,而Caspase-9 mRNA的表达无明显变化。 结论 Plk1基因在肝细胞癌组织及肝癌细胞系细胞中存在过表达,其高表达可能是肝细胞癌发生过程中的一个关键的早期因素。 靶向Plk1的siRNA能够抑制肝癌细胞系BCL-7402细胞中Plk1基因的表达,同时增加p53基因的表达,导致肝癌细胞系细胞周期G_2/M期阻滞,促进肝癌细胞的凋亡。 靶向Plk1的siRNA促肝癌细胞凋亡的途径与内源性的线粒体和内质网途径及外源性的死亡受体相关途径均有关。
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R735.7

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【参考文献】
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