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PAK1互作蛋白ZCW生物学特性的研究

王桂玲  
【摘要】: 目的 最近的研究表明,肿瘤细胞信号传导通路的异常是导致肿瘤发生发展的主要原因。胃癌是我国最常见的恶性肿瘤,其发病率在我国近年来持续上升。因此胃癌发病机制及其诊断治疗的研究是我国目前肿瘤研究的一个重要课题。 激酶在细胞信号转导过程中起到枢纽作用,这使它们在许多种肿瘤的治疗中成为有效的药物作用靶点。PAK1(P21-activated kinase1)是一保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,为Rho家族小鸟苷三磷酸酶(Rho-GTPase)Cdc42和Rac1下游重要的靶蛋白。最近的研究表明它在癌症信号传导网络中起到关键的调节作用。PAKs可以被很多种细胞外刺激因子激活,参与许多重要的细胞活动如:细胞骨架重组、细胞周期演进、凋亡与存活、基因转录调节及癌细胞侵袭转移等。PAK1所具有的广泛生物学功能是由于其磷酸化下游靶蛋白引起的。到目前为止,已经发现了多种PAK1的底物及其相互作用蛋白。并且许多证据足以表明在肿瘤发生发展过程中存在PAK1信号转导途径。研究发现PAK1激酶在肿瘤细胞中存在广泛的过表达现象,并与细胞的恶性转化和癌细胞的侵袭性有着密切的联系,因此可以通过抑制PAK1的表达来抑制肿瘤生长。干扰PAK1信号转导途径有望成为肿瘤分子水平的干预靶点。因此对于PAK1及其下游分子的研究尤为重要。 ZCW是我们利用酵母双杂交的方法,从乳腺上皮细胞cDNA文库中筛选了一个新的PAK1作用蛋白。生物信息学预测分析ZCW蛋白含有970个氨基酸(AA),在其N-末端432-481AA区域含有一个新的CW(半胱氨酸-色氨酸)型锌指结构域,定位在细胞核内,可能作为一个转录因子发挥生物学作用。 本研究在李丰教授前期工作基础上,采用BGC-823和SGC-7901等胃癌细胞系为研究对象,在体外和体内进一步证实PAK1蛋白与ZCW蛋白相互作用并确定磷酸化位点;用染色质免疫沉淀和启动子报告基因等分子细胞生物学技术研究PAK1调控ZCW转录因子的功能及其机制,探讨在胃癌发生发展中的作用,为胃癌治疗提供药物靶点。 方法 1、GST-pull down实验体外证实PAK1能与ZCW发生相互作用。 克隆PAK1和ZCW基因的cDNA全长,构建不同质粒载体中;GST-pull down实验确定PAK1与ZCW相互作用区域。 2、激酶分析实验验证PAK1磷酸化ZCW,并确立磷酸化位点。 首先确定PAK1与ZCW磷酸化区域;在这个区域通过RXXS/T模序确立磷酸化位点,PCR方法进行定点突变(丝氨酸或苏氨酸→丙氨酸)并构建GST-ZCW融合载体,纯化ZCW野生型和ZCW突变体蛋白进行体外激酶实验。 3、Northern Blot和Western Blot法筛选PAK1和ZCW高表达的胃癌细胞株,在ZCW低表达的SGC-7901胃癌细胞中转染pcDNA-3.1A-ZCW-wt,经G418筛选并检测建立ZCW稳定高表达的细胞株,同时用空载体pcDNA-3.1A做对照。 4、细胞内共定位法证实PAK1蛋白与ZCW蛋白发生相互作用。 在真核细胞中表达PAK1和ZCW,并进行亚细胞定位;在EGF或血清刺激条件下,共转染GFP-PAK1-wt和pcDNA3.1A-ZCW-wt,观察pcDNA3.1A-ZCWwt或内源性ZCW的定位变化及与PAK1的共定位。 5、酵母交配实验证实PAK1蛋白与ZCW蛋白发生相互作用 构建诱饵蛋白pGBKT7-PAK1(1-270)和pGBKT7-PAK1(270-545)载体;构建其作用蛋白pGADT7-ZCW和阳性对照蛋白pGADT7-Cdc42和pGADT7-Rac1的载体;酵母交配实验验证PAK1与ZCW蛋白相互作用。 6、免疫共沉淀实验证实PAK1蛋白与ZCW蛋白发生相互作用。 选取人胃癌7901-ZCW稳定细胞株,以7901-3.1A稳定细胞株为对照,在非变性条件下收集细胞,加1x IP buffer收集蛋白,超声破碎后离心去除不溶物。加入适量的PAK1多克隆抗体,4℃轻轻摇动混匀过夜,再加入30ul protein Aagarose Beads混合2小时,以1x IP buffer洗Besds 5次,Western Blot检测共沉淀的ZCW蛋白。进一步证实ZCW蛋白与PAK1在细胞内的相互结合。 7、RNAi干扰技术分析ZCW的生物学功能 RNAi阻断技术PAK1表达,Western Blot方法检测PAK1阻断的特异性和ZCW的表达;免疫共焦激光显微镜原位观察ZCW的定位变化。RNAi阻断ZCW表达,Western Blot法筛选三对ZCW RNAi阻断的特异性并检测下游靶基因p21(Waf1/Cip1)表达的影响。 8、Northern Blot和RT-PCR方法检测ZCW对下游靶基因p21(Waf1/Cip1)表达的影响 选取人胃癌7901-ZCW稳定细胞株,以7901-3.1A稳定细胞株为对照,在EGF干预的条件下,Northern Blot和RT-PCR法分别比较分析p21(Waf1/Cip1)在7901-ZCW稳定表达细胞株与对照组7901-3.1A稳定细胞株的表达情况。 9、利用Dual-Luciferase Assay System分析ZCW对靶基因p21(Waf1/Cip1)启动子的调控 构建pGL3-P21(Waf1/Cip1)-promoter(2.3kb)-Luciferase reporter载体,用pRL-TK载体做内对照,转染ZCW和PAK1质粒分析ZCW对其转录活性的调节,同时分析PAK1对ZCW转录活性的调控。 10、染色质免疫沉淀技术(ChIP)分析ZCW蛋白作为转录因子与靶基因p21(Waf1/Cip1)的特异DNA结合 选取人胃癌7901-ZCW稳定细胞株,以7901-3.1A稳定细胞株为对照。收集蛋白并进行处理,分别留出Input为对照,加入ZCW特异抗体孵育过夜,加入适量鲑鱼精DNA/蛋白A琼脂糖,进行样品处理和收集,分别以p21(Waf1/Cip1)启动子区的三对引物进行PCR,检测ZCW与p21(Waf1/Cip1)启动子区的DNA结合。 结果 1、体外GST-pull down证实PAK1能与ZCW发生相互作用 已获得PAK1和ZCW基因的编码区全长,并构建不同实验用途的质粒载体中;GST-pull down实验确定PAK1与ZCW能相互作用。结果显示PAK1与ZCW的C-末端657-781AA区域发生作用,而ZCW与PAK1 N-末端的75-132AA区域相互作用。 2、激酶分析实验验证ZCW是PAK1磷酸化的底物。 激酶实验分析PAK1蛋白与ZCW蛋白C-末端657-781区域发生磷酸化。对ZCW四个磷酸化位点进行定点突变(Ser→Ala),对突变体进行分析,结果第663、668和711丝氨酸都能被PAK1磷酸化;而第677丝氨酸突变为丙氨酸后,不能被PAK1磷酸化。因此PAK1与ZCW发生磷酸化位点在第677丝氨酸。 3、Northern Blot和Western Blot法选取了PAK1和ZCW高表达的胃癌BGC-823细胞系为实验对象,并选取SGC-7901胃癌细胞系建立ZCW稳定表达细胞系。 4、细胞内共定位法证实PAK1蛋白与ZCW蛋白发生相互作用。 间接免疫荧光显示内源性PAK1蛋白大部分定位在BGC-823胃癌细胞的胞浆中,少量定位在细胞核。而ZCW蛋白主要定位在细胞核。在EGF或血清刺激条件下,转染GFP-PAK1-wt或共转pcDNA-ZCW-wt分别观察内源性和外源性ZCW主要定位在细胞浆,少量在细胞核,并在细胞浆中与PAK1共定位。 5、酵母双杂交实验证实PAK1蛋白与ZCW蛋白发生相互作用。 成功构建诱饵蛋白pGBKT7-PAK1(1-270)和pGBKT7-PAK1(270-545)载体和其作用蛋白pGADT7-ZCW和阳性对照蛋白pGADT7-Cdc42和pGADT7-Rac1的载体,并进行酵母交配实验验证PAK1(1-270)区域与ZCW蛋白相互作用。 6、免疫共沉淀实验证实PAK1蛋白与ZCW蛋白发生相互作用。 选取人胃癌7901-ZCW稳定细胞株,以7901-3.1A稳定细胞株为对照,分别用ZCW和PAK1多克隆抗体进行免疫共沉淀,用ZCW和pcDNA3.1载体上的His标签抗体进行Western Blot,结果检测ZCW蛋白与PAK1在细胞内的相互结合。 7、RNAi干扰技术研究ZCW生物学动能 Western Blot方法结果检测Specific siRNA PAK1对PAK1具有特异性的阻断,而对高度同源的PAK2蛋白表达没有影响。同时检测对其作用蛋白ZCW的表达没有影响。通过设立PAK1 siRNA和PAK1 Control siRNA,免疫共焦激光显微镜原位观察PAK1 siRNA组,ZCW蛋白的定位主要在细胞核;而PAK1Control siRNA组,ZCW蛋白的定位主要在细胞浆。通过Western Blot法筛选出一对高阻断ZCW蛋白的ZCW RNAi。干扰ZCW后,Western Blot结果显示p21(Waf1/Cip1)蛋白表达与对照组相比明显增多;当ZCW高表达时,Western Blot结果显示p21(Waf1/Cip1)蛋白表达与对照组相比明显减少,说明ZCW下调p21(Waf1/Cip1)的表达。 8、Northern Blot和RT-PCR方法检测ZCW对下游靶基因p21(Waf1/Cip1)表达的影响 选取人胃癌7901-ZCW稳定细胞株,以7901-3.1A稳定细胞株为对照,在EGF干预的条件下,Northern Blot和RT-PCR检测在7901-ZCW稳定细胞株中低表达,而在对照组7901-3.1A稳定细胞株中p21(Waf1/Cip1)高表达。 9、利用Dual-Luciferase Assay System分析ZCW对靶基因p21(Waf1/Cip1)启动子的调控 利用pGL3-P21-promoter(2.3kb)-Luciferase reporter载体,荧光结果显示ZCW下调P21(Waf1/Cip1)-promoter的活性,同时显示PAK1能调控ZCW对P21(Waf1/Cip1)的抑制作用。 10、染色质免疫沉淀技术(ChIP)分析ZCW蛋白作为转录因子与靶基因p21(Waf1/Cip1)的特异DNA结合 选取人胃癌7901-ZCW稳定细胞株,以7901-3.1A稳定细胞株为对照,用ZCW特异抗体孵育,结果显示ZCW能与p21(Waf1/Cip1)启动子区的DNA结合。 结论 1、PAK1能与ZCW的C-末端657-781AA区域发生作用,并是通过磷酸化ZCW第677丝氨酸实现的。而ZCW是与PAK1N-末端的75-132AA区域相互作用。 2、ZCW蛋白定位在细胞核,其定位的变化受PAK1和EGF的调节,可移位到细胞质内与PAK1共定位。 3、干扰PAK1后,对细胞内ZCW总蛋白表达没有影响;同时也没有引起ZCW蛋白定位的变化。 4、干扰ZCW后,能引起p21(Waf1/Cip1)蛋白高表达;在ZCW高表达的稳定细胞株中,p21(Waf1/Cip1)蛋白低表达。 5、ChIP实验结果显示ZCW能与p21(Waf1/Cip1)启动子区的DNA结合;报告基因实验分析ZCW下调p21(Waf1/Cip1)启动子的活性,而PAK1对ZCW的转录抑制有调控作用。


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