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《中国医科大学》 2007年
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Survivin和JNK在乳腺癌癌变过程中的表达及与相关信号分子的关系

马萍  
【摘要】: Survivin和JNK在乳腺癌癌变过程中的表达及与相关信号分子的关系 目的 生存素(Survivin)是细胞内凋亡抑制蛋白(Inhibitor of apoptosis proteins,IAPs)家族的成员,在人类胚胎组织和大多数肿瘤组织中表达,而在终末分化的正常组织中“沉默”,在细胞中主要以细胞循环调节方式表达在处于增殖阶段细胞的G_2/M期,而在G_1期快速下调,通过有丝分裂促进细胞的异常增殖。抑制生存素的表达将促进细胞凋亡和抑制细胞增殖。 c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH3 terminal kinase,JNK)是有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen activated-protein kinase,MAPK)信号转导通路家族成员,其作用机制复杂,根据不同的刺激信号作用的环节不同。在一些肿瘤细胞凋亡研究中发现,JNK通路的活化起着抗凋亡作用。本研究探讨Survivin和JNK在乳腺癌、乳腺导管上皮非典型性增生及正常乳腺组织的表达,分析它们与乳腺癌临床病理因素的关系,并通过靶向抑制Survivin,观察对JNK信号途径中关键分子的影响。 方法 (1)本研究采用49例乳腺癌、9例重度乳腺导管上皮非典型增生、11例中度非典型增生及6例轻度非典型增生及癌旁正常乳腺组织标本均来自中国医科大学附属第一医院2002-2004年肿瘤外科手术切除的病例。蜡块制成4μm厚切片,经脱蜡,脱苯,水化后,采用免疫组化(SABC法)检测Survivin蛋白和JNK1/2蛋白的表达。结果判定:Survivin正常阳性表达定位于细胞浆,每例切片随机选取5个高倍视野,每个视野计数100个瘤细胞:阳性细胞数<5%为0分,5%-24%为1分,25%-49%为2分,50%-74%为3分,>75%为4分。阳性细胞表达的着色强度:基本不着色为0分,淡黄色为1分,黄色为2分,棕黄色为3分。两者得分相乘,≤1分判定为表达阴性,其余判定为表达阳性。JNK1/2正常阳性表达也位于细胞浆,结果分为5级:阳性细胞数<1%为0级、1%-24%为1级、25%-49%为2级、50%-74%为3级、75%-100%为4级。设定0、1、2级为无表达或低表达,3、4级为高表达。 (2)设计合成特异性靶向Survivin的反义寡核苷酸(Antisense oligonucleotide,ASODN)。使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液,在37℃,5%CO2的培养箱内培养乳腺癌T47D细胞系,在培养瓶中接种,培养24小时,待细胞90%融合后,按说明书操作,将反义Survivin转染至高表达Survivin的T47D细胞中,6小时后结束转染,以正义转染和空白组作对照。 RT-PCR:收集转染组和对照组细胞,提取总RNA并逆转录成cDNA,扩增Survivin,以β-actin为内对照。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后,成像分析。 Western blot:收集转染组和对照组细胞,提取总蛋白,进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,转膜。经凝胶成像系统采集,进行灰度值测定,以β-actin为内对照,计算Survivin的相对表达量。 MTT比色分析法和Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞术检测其对T47D细胞增殖和凋亡的影响。 (3)收集转染组和各对照组细胞,提取总蛋白,Western blot检测对JNK信号通路关键分子MKK7-JNK1/2-c-Jun蛋白表达的影响。 结果 (1)49例乳腺癌中Survivin蛋白表达率为71.6%,浸润性导管癌阳性表达率最高(75.6%),其次为导管内癌(58.5%)、重度非典型增生(55.6%),中度非典型增生(36.4%)。轻度非典型增生(16.7%)。其中浸润性导管癌阳性表达率显著高于中度非典型增生病例。JNK1/2在乳腺癌中高表达率为69.4%,在浸润性导管癌和导管内癌中阳性高表达率相近,分别为70.3%和66.7%,依次略高于重度非典型增生(55.6%)、中度非典型增生(45.5%)和轻度非典型增生(33.3%)。在组织学Ⅰ级病例中JNK1/2高表达率为83.1%,高于在组织学Ⅱ级和Ⅲ级中的表达率。两者的阳性表达与有无淋巴结转移无明显关系。统计学分析表明两种蛋白在乳腺癌中表达有一定的相关性。 (2)反义Survivin寡核苷酸转染T47D细胞,转染后Survivin mRNA和蛋白表达均下调(分别下调了57.9%和35.0%),P<0.05。MTT分析,转染组细胞生长抑制率高于空白对照组。流式细胞术检测发现,转染反义Survivin后,T47D细胞的凋亡率明显增加。 (3)反义Survivin转染T47D细胞,转染后除了下调Survivin的蛋白表达外,MKK7、JNK1/2和c-Jun蛋白的表达也有不同程度的降低。结论 (1)Survivin和JNK1/2在乳腺癌及导管上皮非典型增生病变中均有表达,且两者在乳腺癌中的表达具有一致性。 (2)反义Survivin可下调乳腺癌T47D细胞Survivin mRNA和蛋白的表达,并诱导T47D细胞凋亡,抑制其增殖。 (3)反义Survivin可下调乳腺癌T47D细胞JNK信号通路关键分子的表达。
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R737.9

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