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《中国医科大学》 2007年
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丙酮酸乙酯对急性坏死性胰腺炎大鼠急性肺损伤保护作用的实验研究

朱峰  
【摘要】: 急性肺损伤(acute lung injury,ALI)是重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)的常见并发症,其确切发病机制尚不明确。SAP发病1周内死亡的患者,60%死于ALI/ARDS或伴有ALI/ARDS的多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS),防治肺损伤成为降低SAP死亡率的重要措施。促炎因子拮抗剂或抑炎因子协同剂的作用是近年来急性胰腺炎并发肺损伤防治研究的热点。大量动物实验表明促炎因子拮抗剂或抑炎因子协同剂对急性胰腺炎相关性肺损伤(acute pancreatitis-associated acute lung injury,APALI)防治效果明显,但遗憾的是,对于人来说,几乎没有明显的临床疗效。其原因可能与复杂的炎性因子网络相互作用有关,单一的促炎因子拮抗剂或抑炎因子协同剂的应用,可能导致炎性因子的失衡进一步加重;而且这些药物的药代动力学和毒性效应也限制了这些药物在伴有MODS的重症患者中的应用。再者,试验大多靶向于发病早期的一些炎症介质,而事实上,往往对患者进行干预治疗时,可能全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)的整个级联反应已经启动。而近来在内毒素血症和脓毒症中研究颇多且疗效明显的丙酮酸乙酯(ethyl pyruvate,EP)在急性胰腺炎及其器官功能损伤的可能作用尚未引起足够的重视。 近来研究表明丙酮酸乙酯是一种抗氧化剂和活性氧清除剂,并可调节多种炎症介质的释放,包括早期和晚期炎症介质如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1 protein,HMGB1)等,且无细胞毒性。 基于对以上研究现状的认识,本研究拟通过建立简便、易复制、重复性好的急性坏死性胰腺炎(acute necrotizing pancreatitis,ANP)并发急性肺损伤动物模型,探讨急性坏死性胰腺炎肺损伤的发病机制;观察丙酮酸乙酯延迟应用是否可减轻急性坏死性胰腺炎肺损伤及可能作用机制;并研究大鼠肺组织高迁移率族蛋白B1的表达在急性坏死性胰腺炎肺损伤中的作用及意义。 方法 1、实验动物模型的建立及取材:健康雄性Wistar大鼠72只,体重220~250g,随机分为三组:假手术组(SO)、ANP组及EP治疗组。ANP组及EP治疗组大鼠予逆行性胰胆管注射5%牛磺胆酸钠制作ANP模型,假手术组大鼠仅开腹并翻动十二指肠数次;EP治疗组于制模后经尾静脉或股静脉延迟给予EP溶液(EP溶于乳酸钠林格液中,28mM),每次剂量为40mg/kg。各组大鼠分别于制模后6h、12h及24h取材。 2、酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清TNF-α和IL-6水平; 3、比色法检测肺组织的髓过氧化物酶(MPO)水平、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)活力; 4、半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测肺组织HMGB1 mRNA表达:用经典的Trizol法进行肺组织RNA提取,定量后以其为模板逆转录合成cDNA第一链,然后用HMGB1引物进行PCR扩增,产物经琼脂糖凝胶电泳进行检测; 5、生化法检测血清淀粉酶、血氧变化及观察胰腺、肺组织大体及光镜下的病理变化。 结果 1、随着制模时间的延长,ANP组大鼠血清淀粉酶逐渐升高,腹水量逐渐增加,各时相点动物的胰腺组织均存在不同程度的间质水肿、炎细胞浸润、灶性或片状出血坏死,胰腺及周围组织出现脂肪坏死及皂化斑,并伴血性腹水,呈典型的ANP病理改变;同时肺组织在各时相点形态上出现了不同程度的炎细胞浸润及肺间质、肺泡水肿、出血、灶性或大片肺不张等典型的ALI病理改变;在功能方面,PaO_2进行性下降; 2、ANP组大鼠肺组织的髓过氧化物酶(MPO)活性随着制模时间的延长而升高,EP治疗组与ANP组相比较,肺组织MPO水平均较低,且各时点均有统计学差异(P<0.05) 3、ANP组血清TNF-α和IL-6水平在制模后6h达高峰,12h下降,在此两时点治疗组血清TNF-α和IL-6水平明显低于ANP组(P<0.05); 4、ANP组肺组织HMGB1 mRNA表达水平在制模后12h明显升高,至24h仍维持在高水平,治疗组肺组织HMGB1 mRNA表达水平在制模后12、24h明显低于ANP组(P<0.05); 5、ANP组大鼠肺组织的丙二醛(MDA)水平随着制模时间的延长而升高,而SOD活力则逐渐降低:EP治疗组与ANP组相比较,肺组织MDA水平均较低,且在6h及12h组有统计学差异,SOD活力则均高于ANP组,且各时点均有统计学差异(P<0.05)。 6、同期胰腺、肺病理改变治疗组比ANP组明显减轻,且PaO_2均明显高于ANP组。 结论 1、逆行性胆胰管注射牛磺胆酸钠诱导ANP并发ALI的大鼠模型是成功的,本模型操作方法简单,重复性好。本模型之ANP早期就合并急性肺损伤,表现为肺组织的炎症浸润并有功能障碍。 2、牛磺胆酸钠诱导ANP发生后,可能通过活性胰酶的释放和中性粒细胞、单核巨噬细胞的激活,释放大量损害性炎性介质包括细胞因子如丁NF-α、IL-6等,通过炎症介质作用导致中性粒细胞等炎症细胞在肺部浸润、聚集活化,释放多种损伤因子如多种促炎细胞因子(TNF-α、HMGB1等)及氧自由基等有害物质直接作用于肺组织而致损伤。 3、牛磺胆酸钠诱导ANP发生后,肺组织HMGB1表达增高较晚且持续时间长,因而可能成为ANPALI防治切实可行的潜在干预目标,能给ANPALI提供更广的治疗窗。 4、丙酮酸乙酯具有抗氧化作用,且能明显抑制ANP肺损伤大鼠早期和晚期促炎细胞因子的释放和表达(TNF-α、IL-6、HMGB1),减轻肺组织病理损伤程度。与其他专门调控单一细胞因子的重组蛋白相比,丙酮酸乙酯在ANP肺损伤发病后有较长的“治疗窗”。丙酮酸乙酯对ANP肺损伤的防治具有良好应用前景。
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R657.51;R563.8

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