oxLDL和其受体LOX-1诱导滋养细胞凋亡及与子痫前期发病关系的研究

【摘要】： oxLDL和其受体LOX-1诱导滋养细胞凋亡及与子痫前期发病关系的研究 目的 子痫前期是孕产期严重的并发症，是导致孕产妇和新生儿病死率的重要原因，关于子痫前期的病因和发病机理研究一直是产科的重要课题。目前普遍认为，胎盘浅着床和血管重铸障碍是子痫前期发病的中心环节，而这两者都与细胞滋养细胞浸润能力降低有关。妊娠期若滋养细胞凋亡过度，就可导致这部分细胞不能向子宫蜕膜浸润，或浸润细胞数目减少及对螺旋小动脉内皮细胞替代减少，导致“浅着床”和血管重铸障碍，继而导致子痫前期的发生。 大量心血管病方面的研究证实，氧化修饰低密度脂蛋白(oxidized low densitylipoprotein，oxLDL)oxLDL是引起血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、巨噬细胞损伤和凋亡的重要因子，并且oxLDL可通过多种途径诱导细胞的凋亡。而oxLDL要通过其受体介导而发挥作用。血凝素样氧化低密度脂蛋白受体-1(Lectin likeoxidized low density lipoprotein receptor-1，LOX-1)是近年发现的oxLDL受体，LOX-1介导内皮细胞对oxLDL的摄取和代谢，在血管平滑肌细胞、巨噬细胞、成纤维细胞和血小板均有表达，在胎盘中也有表达。子痫前期常不同程度的存在代谢综合症的表现，其中血脂代谢紊乱在子痫前期中表现比较明显，之前虽已有一些研究报道，但均局限于血浆脂蛋白水平的检测，更深入的研究报道极少。在子痫前期oxLDL是否为疾病发生发展的重要因子，oxLDL是否通过诱导LOX-1的表达而在滋养细胞凋亡和子痫前期发病中发挥作用，目前尚无研究报道。 研究方法 (1)以ELISA方法检测正常孕妇和子痫前期患者血浆oxLDL的变化并进行差异比较。 (2)以免疫组织化学和Westen-blot、RT-PCR方法检测不同孕周正常孕妇和子痫前期患者胎盘滋养细胞LOX-1表达的时空变化；Westen-blot、RT-PCR方法检测不同孕周和子痫前期患者胎盘滋养细胞凋亡相关基因Bax、Bcl-2及Caspase-3表达的变化。 (3)应用具有滋养细胞特性的绒癌细胞株(JEG-3)在体外进行细胞培养实验，用细胞免疫化学、Westen-blot、RT-PCR方法检测oxLDL对滋养细胞LOX-1和凋亡相关基因表达的调控，以LOX-1阻断剂角叉菜胶来进一步检测阻断前后的变化。 结果 一、血浆氧化修饰低密度脂蛋白水平在子痫前期患者较正常孕妇有显著升高，两组比较有显著差异。 二、正常妊娠与子癎前期胎盘组织中LOX-1和凋亡相关基因表达的时空变化 1．LOX-1在正常妊娠与子癎前期胎盘组织中的表达。 (1)免疫组织化学显示LOX-1在早期妊娠绒毛组织中表达于合体滋养细胞及细胞滋养细胞；在中，晚期正常妊娠与子癎前期胎盘组织中均表达在合体滋养细胞、细胞滋养细胞及血管内皮细胞。随着妊娠周数增加，LOX-1表达逐渐增强，不同孕周子癎前期胎盘组织LOX-1表达均强于同孕周正常妊娠胎盘组织。 (2)RT-PCR结果显示，随着孕周增加，胎盘组织LOX-1mRNA表达逐渐增强，不同孕周子癎前期胎盘组织中LOX-1mRNA的表达较同孕周正常妊娠胎盘组织上调。 (3)Westen-blot结果显示，随着孕周增加，胎盘组织LOX-1蛋白表达逐渐增强，不同孕周子癎前期胎盘组织中LOX-1表达较同孕周正常妊娠胎盘组织表达上调。 2．凋亡相关基因Caspase-3、Bax、Bcl-2在正常妊娠与子癎前期胎盘组织中的表达 (1)免疫组织化学显示Caspase-3在早期妊娠绒毛组织中表达于合体滋养细胞及细胞滋养细胞；在中、晚期正常妊娠和子癎前期胎盘组织中均表达在合体滋养细胞、细胞滋养细胞及血管内皮细胞。随着妊娠周数增加，Caspase-3表达逐渐增强，不同孕周子癎前期胎盘组织Caspase-3表达均强于同孕周正常妊娠胎盘组织。 (2)RT-PCR结果显示，随着孕周增加，Caspase-3、Bax mRNA表达逐渐增强，而Bcl-2 mRNA表达逐渐减弱，Bax／Bcl-2逐渐增大。子癎前期胎盘组织Caspase-3、Bax mRNA表达较同孕周正常妊娠胎盘表达增强，而Bcl-2 mRNA表达减弱。 (3)Westen-blot结果也显示，随着孕周增加，Caspase-3、Bax蛋白表达逐渐增强，而Bcl-2蛋白表达逐渐减弱，Bax／Bcl-2逐渐增大。子癎前期胎盘组织Caspase-3、Bax蛋白表达较同孕周正常妊娠胎盘组织表达增强，Bcl-2蛋白表达减弱。 三、oxLDL对JEG-3细胞系LOX-1和凋亡相关基因表达的调控 1．LOX-1和Caspase-3在JEG-3细胞中的表达 通过细胞免疫化学技术检测到LOX-1和Caspase-3在JEG-3细胞浆及细胞膜中均有表达，为体外调控研究提供实验基础。 2．oxLDL和角叉菜胶对JEG-3细胞LOX-1表达的调控 (1)细胞免疫化学显示，JEG-3细胞未经oxLDL处理时，仅有微弱的LOX-1表达，经oxLDL处理24小时和48小时后，细胞外观未见明显变化，但细胞的LOX-1表达显著增强。同时加入LOX-1抑制剂角叉菜胶后，又逆转上述作用。 (2)RT-PCR进一步显示，oxLDL可剂量依赖性和时间依赖性的诱导JEG-3细胞LOX-1 mRNA表达。当加入LOX-1抑制剂角叉菜胶后，可逆转上述作用。 (3)Westen-blot也显示，oxLDL可剂量依赖性和时间依赖性诱导JEG-3细胞LOX-1蛋白表达，加入LOX-1抑制剂角叉菜胶则LOX-1表达又下调。 3．oxLDL和LOX-1抑制剂角叉菜胶对JEG-3细胞凋亡相关基因Caspase-3、Bax、Bcl-2表达的调控 (1)细胞免疫化学显示，JEG-3细胞未经oxLDL处理时，Caspase-3表达较微弱，经oxLDL处理24小时和48小时后，细胞外观未见明显变化，但细胞Caspase-3表达显著增强。在oxLDL作用基础上加入LOX-1抑制剂角叉菜胶继续培养后，又可逆转上述作用。 (2)RT-PCR显示，oxLDL可剂量依赖性和时间依赖性地诱导JEG-3细胞Caspase-3、Bax mRNA的表达，抑制Bcl-2 mRNA的表达，随着oxLDL作用浓度和作用时间的增加，Bax／Bcl-2增大。在oxLDL作用基础上同时加入LOX-1抑制剂角叉菜胶后，可逆转上述作用。 (3)Westen-bolt也同样显示oxLDL可剂量依赖性和时间依赖性地诱导JEG-3细胞Caspase-3、Bax蛋白的表达，下调Bcl-2蛋白的表达，随着oxLDL作用浓度和作用时间的增加，Bax／Bcl-2增大。在oxLDL作用基础上同时加入LOX-1抑制剂角叉菜胶后，又逆转上述作用。 结论 (1)子痫前期患者血浆oxLDL水平显著高于正常孕妇，提示oxLDL可能参与了子痫前期的病理生理过程。 (2)在体研究显示，LOX-1在早期妊娠绒毛组织中表达于合体滋养细胞及细胞滋养细胞；在中、晚期正常妊娠与子痫前期胎盘组织中均表达在合体滋养细胞、细胞滋养细胞及血管内皮细胞。随着妊娠周数增加，LOX-1表达逐渐增强，子瘸前期胎盘LOX-1表达强于相同孕周正常妊娠胎盘组织。同时随着孕周增加，胎盘组织中凋亡相关基因Caspase-3、Bax表达逐渐增强，而Bcl-2表达逐渐减弱，Bax／Bcl-2逐渐增大。子癎前期胎盘组织Caspase-3、Bax表达均比同孕周正常妊娠胎盘组织表达增强，Bcl-2表达减弱，Bax／Bcl-2增大。提示oxLDL受体LOX-1可能参与了子痫前期的发病，并与滋养细胞凋亡有关。 (3)以具有早期滋养细胞特性的绒癌细胞株JEG-3细胞进行体外培养研究显示，oxLDL可剂量依赖性和时间依赖性的诱导JEG-3细胞LOX-1的表达。同时加入LOX-1抑制剂角叉菜胶后，又可逆转上述作用。结果还显示oxLDL可剂量依赖性和时间依赖性地诱导JEG-3细胞Caspase-3、Bax的表达，抑制Bcl-2的表达，随着oxLDL作用浓度和作用时间的增加，Bax／Bcl-2升高；同时加入LOX-1抑制剂角叉菜胶后，又可逆转上述作用。提示oxLDL可诱导滋养细胞LOX-1的表达，并可能导致滋养细胞凋亡增加，为进一步解释子痫前期的发病机制提供了实验基础。