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《中国医科大学》 2007年
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骨髓间充质干细胞体内移植治疗肝硬化的初步实验研究

刘悦  
【摘要】: 目的 肝硬化(hepatic cirrhosis)是肝脏发生的慢性、进行性改变。病理上以肝组织弥漫性纤维化、假小叶和再生结节形成为特征,临床表现为肝功损害和门脉高压。肝硬化是我国常见疾病和主要死亡病因之一。目前,临床上针对肝硬化的各种治疗方法均存在某些弊端,尚无安全有效的最佳疗法。近年来,骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)因其具有多向分化潜能而成为备受关注的种子细胞。鉴于此,本实验以体外分离培养BMSCs并建立肝硬化动物模型为基础,通过体内直接输注BMSCs来检测其是否可以改善受损肝脏的肝功能,为BMSCs临床治疗肝硬化的可行性提供实验依据。 实验方法 一、BMSCs的分离纯化及表面标志物的检测 1、BMSCs的分离纯化 选取四周龄100-120g健康雄性SD大鼠,获取BMSCs,在37℃、5%CO_2条件下,用含10%胎牛血清的L-DMEM培养液进行贴壁培养。当细胞达到80%-90%融合时,以1:2的比例进行传代培养,三代后获取较为纯化的BMSCs。 2、BMSCs的生长曲线测定 取生长良好的1代和3代细胞,消化后以1×10~4/ml的密度接种于24孔板内。此后,每天取三孔计数,并计算均值,连续9天。据此绘出BMSCs的生长曲线。 3、BMSCs表面标记物的测定 取3代较为纯化BMSCs细胞,应用免疫荧光法检测BMSCs表面标记物CD29、CD44的阳性表达并计算其阳性率。 二、大鼠肝硬化模型的建立 健康雌性SD大鼠80只,体重150-180g,饲养一周后随机分为三组:正常组(20只),普食普水;实验对照组(30只)和实验组(30只)均皮下注射40%四氯化碳和60%植物油混合液,0.3ml/kg体重,每周两次,连续注射八周,实验期间给予正常饮食。八周后取正常组、实验组和实验对照组大鼠肝脏作病理切片观察肝脏改变情况。 三、BMSCs输注后肝功测定 向实验组大鼠体内输注纯化的BMSCs,分别于一、二、三、四周处死大鼠,收集血清,检测肝功指标,观察肝脏恢复情况。 实验结果 1、成功培养出了BMSCs,并获得较为纯化的细胞;描绘出了BMSCs生长曲线图;检测了BMSCs的表面标记物CD29和CD44,阳性细胞数分别为9.75×10~4/ml和9.5×10~4/ml,阳性率分别为97.5%和95%。 2、建立了大鼠肝硬化模型。 3、血清学检测法检测了BMSCs输注后肝功的改变。 结论 1、可以通过体外全骨髓培养法获得纯化的BMSCs,同时证明了BMSCs具有旺盛的增殖能力。CD29和CD44可以在BMSCs表面呈强阳性表达。 2、验证了皮下注射CCL4和植物油混合液可以获得死亡率较低的比较可靠的动物模型。 3、肝脏直接多点注射和尾静脉注射均可成功将BMSCs植入体内并在一定程度上辅助改善肝功能。
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R575.2

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【参考文献】
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