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《中国医科大学》 2006年
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HaCaT细胞系与皮肤鳞癌细胞系SCL-1蛋白质组差异分析的研究

朱红  
【摘要】: 目的 皮肤鳞状细胞癌简称皮肤鳞癌,起源于表皮和皮肤附属器的角质形成细胞,是侵袭性癌,其发生发展的机制尚不十分清楚。HaCaT细胞系源于人类表皮的角质形成细胞,SCL-1细胞系源于人皮肤鳞状细胞癌的瘤细胞,因而它们分别是研究人类表皮角质形成细胞和皮肤鳞状细胞癌生物学的理想模型。应用蛋白质组学研究技术可以高通量发现不同组织细胞间蛋白质的变化,而且可以通过特异性的差异蛋白作为疾病诊断治疗的分子标记。本研究利用蛋白质组学核心技术双向电泳和质谱技术,分析和鉴定HaCaT细胞系和SCL-1细胞系的差异蛋白,为阐明皮肤鳞状细胞癌发病机制并为其诊断治疗提供依据。 实验方法 1.HaCaT细胞系与SCL-1细胞系蛋白质组双向电泳图谱的建立及其差异分析 1.1细胞培养 在37℃、5%CO_2条件下,用含10%胎牛血清的RPMI1640细胞培养液(含青霉素100U/mL、链霉素100μg/mL)分别培养HaCaT细胞和SCL-1细胞于75cm~2培养瓶中,当细胞达对数生长时,用0.25%胰蛋白酶消化,分别收集HaCaT细胞和SCL-1细胞后,室温下PBS液冲洗、1 000 r/min离心三次,收集细胞-70℃冻存或立即用于样品制备。 1.2制备蛋白质样品 将收集到的细胞与裂解液按1:5体积的比例混匀,冰浴静止反应一小时后,12 000 r/min、15℃离心1h,收集上清液,Bradford法测定其蛋白浓度,分装,-70℃保存备用。 1.3等电聚焦 使用17cm(pH 3~10L,pH 4~7L,pH 5~8L)IPG胶条,在PROTEANIEF等电聚焦仪上聚焦,上样量为1.2mg,上样体积为350ul。50V,20℃主动水化13h;250V线性升压30min、1 000V快速升压1h;10 000V线性升压5h;10 000V快速升压60 000Vh。每根胶条的极限电流为50μA,等电聚焦的温度为20℃。 1.4平衡与SDS-PAGE电泳 经两步平衡后SDS-PAGE电泳,30v 30min,加压至120v,直到溴酚蓝泳至玻璃板前缘0.5cm止。 1.5染色和图像分析 考马斯亮兰染色后,利用Image Master 2D 4.10软件对HaCaT细胞与SCL-1细胞蛋白质组双向电泳图谱进行蛋白质斑点差异分析。 1.6选择清晰匹配差异点手工切取后进行质谱分析 2.HaCaT细胞系与SCL-1细胞系差异蛋白鉴定分析 2.1蛋白质组差异分析 重点分析HaCaT细胞系与SCL-1细胞系高差异蛋白 2.2选取12个差异点作质谱测定 选取原则是:可重复,非边缘化,斑点清楚,匹配关系肯定,肉眼可见。所获质谱结果经数据库查询,再综合表观分子量、等电点判定结果。 先将考染蛋白样品酶解,然后提取肽段,再在N_2下吹干浓缩,最后进行MALDI-TOF-TOF MS蛋白鉴定。 实验结果 1.建立了HaCaT细胞系和SCL-1细胞系蛋白质组双向电泳图谱。 2.在pH 4~7L IPG胶条上,HaCaT细胞系和SCL-1细胞系中分别检测到(690±39)个和(665±31)个蛋白质点,其中匹配的蛋白点为396±34)个,三张同一样本(HaCaT细胞系及SCL-1细胞系蛋白质样本)蛋白质斑点匹配率分别为72.6%和71.9%。 3.对表达上调的蛋白质斑点进行质谱分析,经数据库检索,初步鉴定在HaCaT细胞系中表达上调的蛋白是:prohibitin;dUTP焦磷酸酶;chain B,the 2.1 a structure of a tumour suppressing serpin;eukaryotic translation initia-tion factor 3,subunit 2 beta;sfrsl protein。在SCL-1细胞系中表达上调的蛋白是:原肌球蛋白-4,热休克蛋白-27,磷酸丙糖异构酶;KRTHB1;chainB,X-ray crystal structure of human galectin-1。 结论 获得了重复性好的HaCaT细胞系与SCL-1细胞系蛋白质组双向电泳图谱,两个蛋白质组间蛋白质有差异。鉴定了部分差异蛋白质,为阐明皮肤鳞状细胞癌发病机制并为其诊断治疗提供了新思路。
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:R739.5

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【参考文献】
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