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《中国医科大学》 2008年
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毛囊培养上清液诱导骨髓间充质干细胞分化的初步研究

王慧君  
【摘要】: 目的 皮肤是人体最大的器官,在抵御微生物入侵,紫外线辐射以及防止水分的丢失、调节体温方面起重要作用,同时也是免疫系统的组成部分之一。皮肤创伤后的再生以及修复,主要是由邻近、健康的细胞分裂、增殖来实现的。但是大面积Ⅲ度烧伤、广泛瘢痕切除、外伤性皮肤缺损以及皮肤溃疡等导致的严重皮肤缺损,特别是大面积Ⅲ度烧伤,伤及皮肤全层及其附属器,仅靠创面自身难以实现皮肤的再生,因而需要足够的皮肤替代物进行修复。虽然组织工程化皮肤是世界上第一种获得批准的组织工程产品,并在治疗顽固性溃疡和严重烧伤患者方面取得很好的疗效,但是迄今未能合成含有皮肤附属器(毛囊、汗腺、皮脂腺等)的皮肤。因此,目前尚无一种人工皮肤能完全满足创面修复在功能上的需要,存在的一个共同问题是均不能重建毛囊、汗腺、皮脂腺等皮肤附属器,降低了皮肤对环境的适应能力,如何实现皮肤的功能重建成为当前创伤修复的研究热点。 干细胞理论技术的发展为在重建皮肤创伤组织解剖结构的同时恢复其生理功能带来了希望。干细胞具有终身、无限增殖能力,而且在一定条件下,可以分化为各种功能的细胞。干细胞主要包括胚胎干细胞和成体干细胞两大类。胚胎干细胞由于涉及伦理学问题,目前大规模的基础研究和临床应用受到一定限制,因此成体干细胞的研究倍受重视。虽然近年来毛囊干细胞成为组织工程的新种子细胞备受关注,但是毛囊干细胞的分离纯化技术还不完善,而且没有建立完善的培养扩增体系。在一定条件下,具有自我更新与多向分化潜能的成体干细胞即骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)可以分化为同胚层的骨、软骨、脂肪、心肌细胞以及肝细胞等,也可以跨胚层分化为肺上皮细胞、肠上皮细胞、神经细胞以及表皮细胞等。由于MSCs取材方便,分离培养技术简单,具有高度增殖性且体外培养时保持了生物学特性的稳定,扩增以及导入外源基因也相对方便,并且通过骨髓穿刺从自体获得,因此由它诱导来的细胞在进行移植时不存在组织配型及免疫排斥的问题,目前MSCs已成为细胞移植的首选靶细胞。有报道,MSCs经自体移植作用于创面局部后,在皮肤微环境中分化为血管内皮细胞、表皮细胞和皮脂腺导管细胞。因此,MSCs在未来的皮肤创伤修复的实际应用中具有潜在的优势。 MSCs分化的机理和诱导条件迄今为止还不清楚,大多数人认为MSCs的分化与其所处的微环境“壁龛”密切相关,不同的组织细胞微环境有着不同的细胞因子,可能是诱导MSCs获得靶组织的表型,并向不同细胞谱系分化的主要原因之一。已有研究证实,视网膜细胞培养上清液可以诱导骨髓间充质干细胞向神经元、胶质细胞与视细胞分化。本实验采用毛囊培养上清液模拟体内的微环境,探讨MSCs是否具有向毛囊干细胞分化的潜能,从形态学、免疫细胞化学、免疫荧光细胞化学以及基因表达等多个方面鉴定,从而探讨MSCs在将来皮肤创伤修复实际应用中的潜在优势,促使人们探讨能否利用骨髓间充质干细胞的诱导分化来重建皮肤的解剖结构和生理功能。 方法 体重100g雄性Wistar大鼠脱颈椎处死,采用贴壁法,通过差速贴壁法去除非贴壁的造血细胞,获得相对均质的MSCs,细胞爬片,固定,进行CD44、CD29免疫细胞化学染色鉴定。无菌条件下,取上述同一只Wistar大鼠触须部皮肤,用显微外科器械分离毛囊于24孔培养板中,每天收集培养上清液,过滤后与DMEM培养液按2:3混合,用此混合培养液对第3代MSCs进行诱导,倒置显微镜下观察细胞形态的变化,对诱导后的细胞进行K15、CD34免疫细胞化学染色和免疫荧光细胞化学染色,计算细胞转化率,然后利用RT-PCR进一步检测诱导后K15、CD34mRNA的表达。 结果 一、MSCs的分离、培养及鉴定 MSCs原代培养接种后12h可见少数细胞开始贴壁,细胞形态呈成纤维样细胞,并很快形成集落。24h后首次换液,3天后细胞增殖加快,呈集落样迅速生长,7天后细胞达到80%融合,2-3代后MSCs呈梭形,细胞核较大、核仁明显,95%以上形态均匀一致,CD44、CD29免疫细胞化学染色显示细胞膜呈棕黄色。 二、毛囊的器官培养及观察 毛囊接种培养后第1天,大部分毛囊开始生长,表现为毛囊逐渐延长,生长延长主要集中在前4天,到第7天后部分毛囊开始贴壁,逐渐发现有成纤维样细胞和上皮样细胞从毛囊长出,并逐渐增殖生长,呈铺路石样,到第10天以后毛囊大部分贴壁,生长缓慢,基本无变化。 三、MSCs在条件培养液诱导后的培养、观察及鉴定 1、第3代MSCs经条件培养液诱导后第7天,可见少数细胞发生形态改变,随着时间的延长,逐渐由原来的梭形向角质样细胞的形态转变。 2、第3代MSCs诱导21天后,K15、CD34免疫细胞化学染色和免疫荧光细胞化学染色显示部分阳性细胞,K15阳性率为62.8%,CD34阳性率为35.5%,未诱导的骨髓间充质干细胞中CD34、K15呈阴性。 3、第3代MSCs体外诱导21天后,RT-PCR检测CD34、K19表达阳性。 讨论 大面积皮肤烧伤、慢性溃疡、创伤、皮肤肿瘤切除或其它皮肤疾病,导致皮肤全层及其附属器的严重缺损,需要足够的皮肤替代物进行修复。目前尚无一种人工皮肤能完全满足创面修复在功能上的需要,存在的一个共同问题是均不能重建毛囊、汗腺、皮脂腺等皮肤附属器,降低了移植皮肤对外界环境的适应能力,如何实现皮肤移植后的功能重建成为当前创伤修复的研究热点。 由于MSCs取材方便,分离培养技术简单,具有高度增殖性且体外培养时保持了稳定的生物学特性,扩增以及导入外源基因也相对方便,由它诱导来的细胞在进行移植时不存在组织配型及免疫排斥的问题,目前已成为组织工程中细胞移植的首选靶细胞。王海萍等利用5-氮胞苷(5-aza)诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞。本实验室潘峰等成功地诱导MSCs向成骨样细胞方向分化。已有研究证实MSCs经自体移植作用于创面局部后,在皮肤微环境中分化为血管内皮细胞、表皮细胞和皮脂腺导管细胞。Nakagawa等人通过将MSCs种植到人工皮肤上以修复皮肤缺损的裸鼠,证实MSCs具有促进伤口愈合的潜能。MeFarlin等人将MSCs注射到皮肤损伤的部分,证实MSCs能有效促进皮肤创面的愈合。虽然在皮肤组织工程中,毛囊干细胞作为种子细胞的研究已取得进展,但是其分离和纯化还有待于进一步研究。本实验利用每天收集的毛囊培养上清液模拟体内的微环境,毛囊器官培养过程中分泌的细胞因子(KCF、FGF、VEGF等)不断作用于MSCs,培养3周后可以看到诱导后的细胞具有典型的角质样细胞的形态特征,呈多角形,胞核偏大,特异性地表达K15、CD34,K15、CD34是近两年来发现的在毛囊干细胞高表达的分子标记,表明在毛囊培养液的诱导下,MSCs具有向毛囊干细胞分化的潜能,为诱导MSCs进一步分化为表皮、真皮以及皮肤附属器奠定了基础。 本实验利用毛囊培养上清液诱导MSCs分化为毛囊干细胞样的细胞,使得合成具有完整解剖结构和良好功能的皮肤成为可能。本实验初步证明了在体外的诱导条件下,MSCs具有向毛囊干细胞分化的巨大潜能,并且为进一步分化为表皮、真皮和皮肤附属器的研究奠定了基础,但是,MSCs诱导后进一步分化为皮肤附属器的可能性需进一步做严格的动物实验,进行深入细致的探究,另外,MSCs向毛囊干细胞分化的分子机制以及分化后细胞的功能有待于进一步研究。 结论 骨髓间充质干细胞在毛囊培养上清液的诱导下可以分化为毛囊干细胞样的细胞。
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:R329.4

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