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《中国医科大学》 2008年
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STK15的表达对NIH3T3细胞的影响及STK15转基因小鼠模型的建立

朱焱  
【摘要】: 目的 STK15基因是丝/苏氨酸激酶家族成员之一,STK15基因在多种恶性肿瘤组织中都具有高表达,其扩增和高表达能引起中心体复制扩增,染色体不稳定性增加,最终导致细胞的恶性转化,从而诱发恶性肿瘤。现阶段国内外文献对STK15基因的功能在细胞水平的报道还很少,为了进一步研究STK15基因与恶性肿瘤发生发展的关系,本实验利用pcDNA3.1-STK15质粒体外瞬时转染成纤维细胞NIH3T3,观察STK15高表达对NIH3T3细胞的影响,并通过显微注射法,制备携带STK15的转基因小鼠,为研究该基因在恶性肿瘤中的作用,提供了很好的动物模型。 方法 首先提取人胚肺细胞总RNA作为模版,根据GenBank中STK15基因序列设计一对引物,用RT-PCR技术扩增出1200bp的STK15基因全长,克隆到pTZ57R/T载体,通过测序证实序列的正确性。用BαmHⅠ和XbaⅠ双酶切空载体pcDNA3.1和pTZ57R/T-STK15连接产物,然后回收、连接、转化、鉴定,从而成功构建了pcDNA3.1-STK15表达质粒。然后将pcDNA3.1-STK15表达质粒体外瞬时转染小鼠成纤维细胞NIH3T3,以转染空载体pcDNA3.1的NIH3T3细胞作对照,应用RT-PCR方法分析STK15在RNA水平的表达;应用免疫细胞化学方法和Western印迹方法分析STK15在蛋白质水平的表达;应用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)实验检测细胞的增殖能力;应用重组人工基底膜(Transwell)实验检测细胞侵袭能力。同时,对小鼠进行超排获得原核期胚胎,将构建的pcDNA3.1-STK15质粒用BgIⅡ和Bst1107Ⅰ双酶切,获取目的基因片段,应用显微注射法进行转基因操作,对新生小鼠通过提取鼠尾基因组DNA、进行PCR和Southern blot方法鉴定。通过提取PCR阳性的转基因鼠的RNA,应用RT-PCR方法分析STK15基因在转基因阳性小鼠各组织的转录特征和表达情况。 结果 重组质粒经酶切、测序等分析插入的基因片段为表达STK15的基因,说明成功构建了pcDNA3.1-STK15表达质粒。然后,用脂质体介导pcDNA3.1-STK15质粒转染小鼠的成纤维细胞NIH3T3,在转染48小时后用RT-PCR的方法检测到STK15mRNA的转录活性明显增强,进一步用Western和免疫细胞化学方法检测到STK15的蛋白表达水平明显增强,说明转染成功。与转染空载体pcDNA3.1的NIH3T3细胞相比,转染pcDNA3.1-STK15质粒的NIH3T3细胞48小时的MTT摄取率显著升高(P<0.05);Trans-well方法检测结果显示,与转染空载体pcDNA3.1的NIH3T3细胞相比,转染pcDNA3.1-STK15质粒的NIH3T3细胞穿透Matrigel胶的细胞数明显增多,说明转染pcDNA3.1-STK15质粒的NIH3T3细胞侵袭能力明显增强。转基因小鼠制备实验,共注907枚受精卵,存活701枚,注射成功率为77%,分别移入30只小鼠输卵管,共产出106只F_0代转基因小鼠。PCR检测转基因阳性鼠为3只,Southern杂交检测转基因阳性鼠一只。将转基因阳性鼠与正常C57BL/6交配,产生F_1代阳性鼠2只;将F_1代阳性鼠与正常C57BL/6交配,产生F_2代鼠3只。通过提取PCR检测阳性的F_0代转基因小鼠的RNA,应用RT-PCR的方法检测到在转基因小鼠的睾丸组织能够转录出STK15mRNA。 结论 pcDNA3.1-STK15质粒体外瞬时转染NIH3T3细胞,可以有效地使STK15基因在RNA水平和蛋白质水平都具有高表达,并且使NIH3T3细胞MTT摄取率和侵袭能力增加,提示STK15基因高表达可以引起小鼠成纤维细胞的增殖和侵袭力的增加,说明STK15基因有增加细胞增殖和细胞侵袭力的功能,进而形成肿瘤。同时,通过显微注射法使外源基因pcDNA3.1-STK15在小鼠基因组中得到整合并表达,建立了转STK15的转基因小鼠模型。
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:Q78

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