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《中国医科大学》 2006年
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PKB介导的bFGF对人大肠癌细胞增殖的影响

林杰  
【摘要】: 目的 大肠癌的发病率与死亡率在我国有上升的趋势。近年来,在大肠癌的预防、诊断和治疗上已有了一些新的进展。开发研制能选择性靶向肿瘤的生长增殖的药物,一直是肿瘤研究努力的方向。 碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)作为一种细胞有丝分裂原和促血管生成因子,在许多肿瘤的生长中起着重要的作用。但对大肠癌细胞这方面的研究报道很少。目前认为,bFGF不仅可以促进肿瘤血管的生成,而且对肿瘤细胞也有促增殖作用。这表明bFGF可能参与肿瘤病理发生的主要途径,具有重要的研究价值。 蛋白激酶B(Protein Kinase B,PKB)是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,PKB是磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol3-Kinase,PI3-Kinase)的直接下游靶蛋白,PKB就成为信号转导深入研究的焦点。PKB在蛋白质和脂类合成、葡萄糖代谢与运输、细胞周期、凋亡和肿瘤转化等方面发挥重要的作用,处于多个信号转导通路的交叉点,成为生长因子介导的PI3-K信号转导通路中的重要组成因子,尤为重要的是PKB介导细胞存活而且在恶性肿瘤发生中也是关键的因素。 周期素是一类存在于细胞周期的不同阶段,能够活化CDK的蛋白,是细胞得以通过细胞周期的各个阶段所必需的。CyclinA是一类在哺乳动物细胞S期和G_2/M期两个调节点均起重要作用的蛋白。 CyclinA在S期可以检测到,在进入G2期含量增加,是细胞增殖的有用标记物。在多种肿瘤中可检测到周期素A表达的增加,提示与肿瘤增殖状态密切相关。 关于碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast.growth factor,bFGF)通过PI3-K/PKB信号途径调控大肠癌细胞生长的具体机制仍不清楚。我们通过改变bFGF作用于Lovo细胞的时间,检测,PKB活性和CyclinA的表达情况,进一步研究bFGF通过H3-K/PKB通路调控大肠癌细胞生长的信号转导机制。因此,我们通过阻断PI3-K/PKB信号转导通路来抑制肿瘤细胞增殖,诱导肿瘤细胞凋亡,这为治疗大肠癌提供了新思路和新方法。 材料与方法 1.用RT-PCR法检测大肠癌组织中bFGFmRNA,PKBmRNA,CyclinAmRNA的表达 2.MTT法分析bFGF对LoVo细胞增殖程度的影响 3.(γ-32~p)ATP掺入法检测大肠癌LoVo细胞株中PKB的活性 4.RT-PCR法检测大肠癌LoVo细胞株中CyclinA的表达 5.Western Blot法检测PKB和cyclinA的表达 实验结果 1.bFGFmRNA,PKBmRNA,CyclinmARNA在大肠癌中的表达 60例大肠癌中,bFGF阳性表达45例(60%),PKB43例(72%),Cyc—lin A 40例(67%);相应癌旁组织中,bFGF阳性表达6例(10%),PKB 21例(35%),CyclinA 3例(5%)。上述三项指标在大肠癌中的阳性表达率均明显高于癌旁组织(P<0.05)。 2.bFGFmRNA,PKBmRNA,CyclinAmRNA的表达水平与临床病理因素的关系 癌组织中bFGF表达明显高于癌旁组织(P<0.01),C期和D期明显高于A、B期(P<0.05),而bFGF的表达水平与大肠癌组织分化程度无关(P>0.05)。 PKB在正常组织和癌旁组织中的表达差异无统计学意义(P>0.05);但其阳性表达率和强度均显著低于大肠癌组织(P<0.05),C、D期阳性表达率高A、B期(P<0.01),PKB在低分化肿瘤中的表达阳性率高于中和高分化肿瘤(P<0.05)。 大肠癌中Cyclin A的表达阳性率与癌旁相比,差异有非常显著性(P<0.01),A、B期无淋巴结转移组明显高于C、D期有淋巴结转移组(P<0.01);在高、中分化肿瘤中Cyclin A明显高于低分化肿瘤(P<0.01)。 3.bFGF对LoVo细胞株PKB活性的影响 bFGF以不同时间作用于LoVo细胞时,通过(γ-~32P)ATP掺入法检测发现可提高细胞PKB活性。PKB的抑制剂LY294002预处理后再施加bF-GF,可显著降低PKB的活性,单因素方差分析表明LY294002预处理组和未做预处理组之间差异有显著性,说明bFGF可通过PI3-K调控PKB的活性。 4.bFGF对LoVo细胞CyclinA表达的影响 bFGF以不同时间作用于LoVo细胞时,CyclinA表达增加,用LY294002预处理后施加bFGF;发现Cyclin A表达减少,说明bFGF可通过PI3-K调节Cyclin A表达增加。 5.Western Blot法检测PKB和cyclinA的表达 bFGF刺激LoVo细胞CyclinA蛋白表达都高于其他各施加因素组,LY294002抑制组蛋白明显降低,而PKB在各组中的表达无明显变化,从而也证实bFGF引起LoVo细胞Cyclin A的蛋白表达是通过PKB之途径而介导。 讨论 现代分子生物学研究表明bFGF过度表达与肿瘤发生、发展及预后有密切关系。在大肠癌中也表现出相似结果,本研究应用RT-PCR技术对60例大肠癌进行bFGFmRNA检测。结果显示,大肠癌中bFGFmRNA基因呈高表达,与正常及癌旁组织比较,有显著差异。且bFGFmRNA基因表达水平与Dukes分期呈显著正相关。提示bFGF在大肠癌的生长、进展、转移中起促进作用。 本研究结果表明,PKB在大肠癌组织中表达的阳性率和强度均明显高于癌旁大肠组织和大肠良性病变组织,也提示PKB在大肠癌的发生过程中可能发挥作用。我们还发现,PKB在晚期大肠癌组织中的表达明显高于在早期大肠癌组织中的表达,在伴有淋巴结转移大肠癌中的表达也显著高于在无淋巴结转移大肠癌中的表达。 cyclinA是一类在哺乳动物细胞S期和G_2/M期两个节点均起重要作用的蛋白。这提示cyclin A的过表达可能是大肠癌发生的早期事件,cyclin A是细胞周期进入S期和M期所必须的调节蛋白,它的过度表达将会使出于S期和G_2/M期的细胞百分比增加,从而影响细胞周期的过程,促进细胞的增殖,因此可能是影响大肠黏膜细胞正常细胞周期重要途径之一。 本试验采用外源性bFGF处理LoVo细胞,显示bFGF能促进Cyclin AmRNA水平的提高,导致Cyclin A的表达增加。已知Cyclin A属S期和G_2期达峰值,PI3-K抑制剂LY294002预处理的细胞,经bFGF刺激后,在各时间点Cyclin A mRNA水平均下降,同时Cyclin A表达水平也降低,表明bFGF对LoVo细胞周期素A表达的影响是通过影响其转录活性实现的,而且这种调节作用依赖于PI3-K/PKB途径。本研究通过体外实验证明PI3-K/PKB途径可介导bFGF对LoVo细胞的促增殖作用,通过调节Cyclin A的转录活性促进其表达进而促进细胞增殖。进一步的体内研究如能证实内源性bFGF通过PI3-K/PKB途径影响CyclinA.表达,将为肿瘤治疗提供新思路和新方法。 结论 1.bFGFmRNA,PKBmRNA,CyclinA mRNA在大肠癌组织中有过度表达,其表达水平与大肠癌Dukes分期有关。且PKBmRNA,CyclinAmRNA的表达水平与大肠癌的组织分化有关。 2.bFGF刺激大肠LoVo细胞后可通过依赖PI3-K/PKB途径调节Cyc-lin A的转录活性促进其表达,进而促进细胞增殖。
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:R735.34

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