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《中国医科大学》 2008年
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半乳糖结合蛋白(Galectin)-9抗肿瘤作用及其在子宫颈癌组织中的表达和临床意义

梁美艳  
【摘要】: 前言 近几十年,尽管人们对蛋白和基因的认识有很大的突破,但对于早期发现的细胞表面广泛存在、表达各异的糖缀合物却知之甚少。Galectin-9是半乳糖结合蛋白家族的成员之一,属于动物凝集素,能够与细胞表面和细胞间质中的半乳糖特异性的结合,发挥细胞之间以及细胞与间质之间的信号传递作用。Galectin-9结构上具有两个羰基结合区域,中间由连接肽连接,具有比较明确的激活嗜红细胞,分化单核细胞的作用。Galectin是细胞质蛋白,可以靶向分泌到细胞核内或在胞浆中,与细胞质和细胞核中的蛋白相互作用,传导细胞信号,调节mRNA的剪切、细胞周期、细胞增殖和细胞的凋亡。或者通过非经典途径和内质网高尔基体复合物,释放到细胞外基质中,连接细胞外基质中包含β-半乳糖苷的糖缀合物和细胞表面的黏附因子,调节细胞的黏附和分化。galectin广泛地分布于细胞内外,在肿瘤的致瘤性转化,肿瘤细胞的存活,新生血管形成和肿瘤转移方面发挥重要作用,同时发现galectin调节免疫和炎症反应并且引导肿瘤逃离免疫监视。 Galectin-9蛋白的肿瘤相关研究刚刚起步,乳腺癌相关研究起步较早,目前已经发现galectin-9蛋白在体外培养的乳腺癌细胞中,具有抗乳腺癌细胞生长,诱导乳腺癌细胞凋亡和促进其细胞积聚体形成的作用,这种体外抗肿瘤作用,为galctin-9蛋白的肿瘤免疫治疗方面的应用,提供可能。在乳腺癌患者组织标本的研究中发现galectin-9蛋白阳性表达的患者生存率显著增加。说明galectin-9蛋白与乳腺癌的发展和转移有关,从而影响乳腺癌患者的生存率。在原位恶性黑色瘤患者的组织标本中发现galectin-9蛋白表达低于黑色素瘤患者,而远处转移的组织标本中缺乏galectin-9蛋白表达,说明galectin-9蛋白与黑色素瘤的发生关系密切。虽然已有证据提示galectin-9蛋白与肿瘤的发生和发展有关,体外细胞培养实验提示galectin-9蛋白具有抗肿瘤作用,但应用于肿瘤治疗上仍然需要大量和广泛的的实验数据的支持。 恶性肿瘤临床表现多种多样,不同的肿瘤也具有各自特征性的表现,子宫颈鳞状细胞癌是妇科常见的恶性肿瘤,具有相对明确的癌前病变期。临床上可能观察到子宫颈癌发生的连续过程,这种连续性的变化有利于研究galectin-9蛋白在肿瘤发生过程中所发挥的作用。因此本研究通过体外培养细胞和实验动物体内试验观察galectin-9蛋白的抗肿瘤作用,并在此基础上,收集子宫颈癌、癌前病变和正常妇女的子宫颈组织和末梢血血清标本,证实galectin-9蛋白的表达情况并分析其与子宫颈癌的发生的关系。 材料和方法 1、不同浓度的安定型galectin-9蛋白分别与纤维肉瘤细胞株Meth A、黑色素瘤细胞株MM-RU和胃癌细胞株KATO-Ⅲ共同培养,通过WST-1方法观察细胞毒性反应,流式细胞仪检测其促进凋亡作用和显微镜下计数细胞颗粒评价肿瘤细胞积聚体形成,通过研究体外培养的肿瘤细胞,综合评价galectin-9蛋白的体外抗肿瘤效果。 2、Galectin-9蛋白对荷瘤鼠种植的肿瘤细胞肿块大小和荷瘤鼠生存率的影响。主要采用鼠尾静脉和腹腔注射两种给药途径,给与galectin-9蛋白的肿瘤治疗方法对Meth A纤维肉瘤C57BL/6J鼠和裸鼠背部肿块大小改变以及对Meth A纤维肉瘤BABL/c鼠生存率的影响,分析galectin-9蛋白在荷瘤鼠体内的抗肿瘤作用,并进一步讨论其抗肿瘤作用的机制。 3、收集子宫颈鳞状细胞癌、癌前病变患者和正常妇女的子宫颈组织标本和末梢血血清标本,用免疫组织化学法检测galectin-9蛋白在组织标本中的表达,ELISA法检测galectin-9蛋白在血清标本中的含量,分析galectin-9蛋白的表达与子宫颈癌的发生发展的相互关系。 结果 1、安定型的galectin-9对体外培养的Meth A肿瘤细胞具有显著的抑制肿瘤细胞生长的作用,随着galectin-9蛋白浓度的增加和作用时间的延长,其抑制肿瘤细胞生长的作用,逐渐增强。Galectin-9蛋白能够促进体外培养的多种肿瘤细胞凋亡;促进多种肿瘤细胞形成积聚体,该作用均表现为作用时间和药物浓度依赖性。提示galectin-9蛋白具有体外抗肿瘤作用。 2、鼠尾静脉和腹腔两种给药方式,给与galectin-9蛋白均能抑制正常荷瘤鼠肿块的生长,延长正常荷瘤鼠的生存时间。但是galectin-9蛋白对于裸鼠体内的肿瘤的生长和荷瘤裸鼠生存时间不产生影响。裸鼠天然的免疫系统欠缺,说明galectin-9蛋白在荷瘤鼠体内抗肿瘤作用是通过提高荷瘤鼠自身的免疫水平而达到的,可以很好的解释galectin-9蛋白对荷瘤裸鼠不产生影响。同时发现galectin-9蛋白抗肿瘤,延长荷瘤鼠的生存率与galectin-9蛋白的浓度和作用时间有关。 3、免疫组织化学显示galectin-9蛋白在子宫颈组织中的表达。在正常子宫颈组织中galectin-9蛋白强表达,随着子宫颈病变的进展,galectin-9蛋白的表达逐渐减弱,宫颈鳞状细胞癌的表达与分化程度密切相关,高分化鳞癌可发现galectin-9蛋白着色,而低分化鳞癌未发现其免疫着色。正常子宫颈上皮中galectin-9的着色集中在细胞质中,子宫颈癌前病变直至子宫颈鳞癌组织细胞质细胞和甚至细胞膜上都发现了galectin-9的免疫着色。Galectin-9蛋白表达水平的改变,说明了该蛋白参与了子宫颈癌的发生。 4、Elisa检测结果显示galectin-9蛋白在血清中的表达情况与组织中的结果相类似,正常患者血清中高表达,随着子宫颈癌前病变到子宫颈癌的发展变化,血清中galectin-9蛋白的含量逐渐下降。正常人组血清中galectin-9蛋白浓度为27.15±14.36pg/ml,CIN组患者血清中galectin-9蛋白浓度为21.20±7.74pg/ml,而子宫颈鳞状细胞癌患者血清浓度为17.43±6.26pg/ml,各组之间具有显著差异(P<0.05)。患者血清中galectin-9蛋白的变化与组织标本中的变化相一致,进一步证实galectin-9蛋白与子宫颈癌的发生相关。 结论 1、galectin-9蛋白通过抑制体外培养肿瘤细胞的生长,促进肿瘤细胞的凋亡和促进细胞积聚体形成的作用,发挥抵抗体外培养肿瘤细胞的作用。 2、ga1ectin-9在荷瘤鼠免疫系统完整的前提下,通过增强荷瘤鼠自身的免疫力,抑制肿瘤的生长,延长荷瘤鼠的生存率。 3、在临床资料中发现在子宫颈癌癌前病变和鳞状细胞癌患者的组织标本和血清中galectin-9的表达均明显下降,提示galectin-9蛋白表达缺失与子宫颈癌的发生有关。 总之,galectin-9蛋白具有抗肿瘤的作用能力,其表达与子宫颈癌的发生发展密切相关,具有临床应用价值。
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:R737.33

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