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《中国医科大学》 2008年
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化学性缺氧对原代培养大鼠心肌细胞葡萄糖转运蛋白4转位的影响及信号调控机制

关付  
【摘要】: 目的 在心肌缺血、缺氧,心脏工作负荷增加以及肥厚性心肌病等病理情况下,心肌代谢以葡萄糖无氧酵解及乳酸氧化为主要能量来源。葡萄糖进入心肌细胞通过易化性葡萄糖转运子(GLUTs)实现。GLUTs的质和量对葡萄糖跨膜转运的速度起决定作用。其中GLUT-4广泛分布于心肌细胞内,在胰岛素及缺血/缺氧等因素作用下发生转位,即从细胞内存储囊泡转位至细胞质膜。有研究表明胰岛素介导的GLUT-4转位为磷酸肌醇3—激酶(PI3K)介导,而缺血/缺氧所致心肌GLUT-4转位机制尚待阐明。有研究提示单磷酸腺苷-激活的蛋白激酶(AMPK)可能是缺血所致GLUT-4转位的主要调节因素之一。本研究利用叠氮化合物诱导原代培养的新生大鼠心肌细胞发生化学性缺氧,观察缺氧条件下心肌细胞葡萄糖摄取及GLUT-4转位情况,进而探讨调控该生物学过程的信号通路是否有AMPK参与。 方法 首先应用低浓度叠氮钠处理原代培养的大鼠心肌细胞,通过细胞活力检测(MTT法)以及凋亡过程分析(Annexin V-FITC+PI双染流式细胞仪测凋亡)确定处理因素的最适条件(最适孵育时间及浓度),制备科学的细胞化学性缺氧模型。然后用或不用氨基嘌呤9-β-D-阿糖呋喃腺苷(ara A,为AMPK抑制剂)预处理,将原代培养的大鼠心肌细胞随机分组,分别进行叠氮钠孵育(化学性缺氧),胰岛素处理,5-氨基咪唑-4-氨基酰-1-β-核糖呋喃腺苷(AICAR,AMPK激活剂)处理等。应用γ-液闪仪测定各组细胞2-[~3H]-脱氧葡萄糖(2-[~3H]DG)的摄取情况,同时通过蛋白质印记免疫分析法(western blot)检测各组细胞膜成份中的GLUT-4蛋白表达水平变化。最后通过AMPK活性检测探讨上述生物学改变的信号调控机制。 结果 1mmol/L叠氮钠孵育心肌细胞3小时,可以诱导心肌细胞发生可逆的化学性缺氧,该缺氧模型重复性好、科学性强、理论依据充分,可以用于心肌细胞缺氧的后续实验研究中。 液闪测定各组心肌细胞2-[~3H]DG摄取率结果显示,与胰岛素的作用相仿,AICAR及叠氮钠均可使心肌细胞葡萄糖摄取率较基础状态显著增加。二者联合处理使心肌细胞葡萄糖摄取率增加较二者单纯处理更显著,而胰岛素与AICAR联合处理后细胞葡萄糖摄取率增加至各处理组中最大。同时,各组细胞膜组分的蛋白质印记免疫分析结果表明,AICAR和叠氮钠均可增加心肌细胞GLUT-4转位(自细胞内GLUT-4存储囊泡至细胞膜),且胰岛素和AICAR联合处理使心肌细胞GLUT-4转位增加最显著。 另一方面,ara A在抑制AMPK激活的同时,削弱了叠氮钠、胰岛素与AICAR联合孵育所致的细胞葡萄糖摄取增加效应,并可完全阻断AICAR引起的葡萄糖摄取增加。同时,ara A显著抑制了上述各组细胞的GLUT-4转位(自细胞内GLUT-4存储囊泡至细胞膜)。 结论 低浓度叠氮钠诱导原代培养的大鼠心肌细胞产生化学性缺氧,该过程为可逆的早期凋亡,此细胞缺氧模型可用于心肌缺血/缺氧相关的基础研究中。 低浓度叠氮钠所致化学性缺氧可以引起原代培养大鼠心肌细胞GLUT-4转位增加(自细胞内GLUT-4存储囊泡至细胞膜)从而增加细胞葡萄糖摄取,该过程的信号调控机制中有AMPK参与。
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:R541

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