高压氧对创伤性休克复苏后大鼠肠道的影响

【摘要】： 目的 目前关于失血性休克胃肠缺血再灌注损伤的机制的学说很多,但是尚未得到彻底的阐明。本研究的目的就是观察高压氧治疗对创伤性休克复苏后大鼠肠道缺血-再灌注损伤的影响并探讨其作用机制。 材料与方法 一、动物分组 健康Wistar大白鼠96只,体重260～300g,雌雄不限,由中国医科大学实验动物中心提供,随机分成四组,每组24只大鼠:对照组(只进行手术操作,不诱导休克);休克组(手术操作诱导休克并进行常规补血、补液复苏);高压氧一次组(休克组+复苏后立即一次高压氧治疗);高压氧三次组(休克组+二十四小时内三次高压氧治疗)。 二、创伤性休克复苏动物模型的建立 大白鼠麻醉成功后平卧固定,手术暴露血管,右股动脉插入套管针,连接血压换能器并与多参数监护仪相连,监测血压;左颈内静脉插入套管针作为复苏通路;右颈总动脉也插入套管针,用来进行放血。用铁块从高处垂直落下砸中左侧大腿,造成股骨骨折和肌肉组织挤压伤。同时通过右颈动脉插管放血,使血压下降造成休克。休克状态60分钟后,将全部放出的自体血经左颈内静脉回输,同时用生理盐水复苏60分钟。复苏后使平均动脉压维持于70～80mmHg以上。 三、高压氧的实施 将大鼠放入氧舱后,先洗舱三次,然后将舱内治疗压力匀速升至0.15MPa且氧浓度大于99.5%,维持恒定的舱内压力和氧浓度共60分钟。最后等速减压,舱内压力为0MPa后取出大鼠。 四、观察指标及取材 休克前、休克后、复苏前、及24小时后作为四个观察时间点,根据这四个时间点将第一部分每组的大鼠再分为四个亚组,每组6只。每个亚组的大鼠按照其对应的时间点活时剖腹,于回盲部用移液管滴注2.5%的戊二醛,于滴注戊二醛的部位取全层的小肠组织约0.5厘米,迅速放于冰块上,再次滴注2.5%戊二醛,然后于冰块上进行清洗,修剪。修成1个立方毫米,立即放入2.5%戊二醛中,留送电镜检查。于回盲部近端(避开滴注戊二醛的部位)取小肠组织块(0.2克-1.0克)后处死,取得的肠在冷生理盐水(0℃-4℃)中漂洗,除去血液,滤纸吸干,称重,放入5ml的小烧杯中,用移液管量取冷的生理盐水,生理盐水的体积应该是组织块重量的9倍,尽快剪碎组织块,然后用Snoiprep150型超声波发生器,以振幅14微米超声处理30秒,使细胞粉碎,制备成10%的肠道组织匀浆,匀浆离心后取上清,—70℃冻存待测。放免法检测肠道组织匀浆TNF-α。比色法检测肠道组织匀浆一氧化氮(NO)。比色法检测肠道组织匀浆诱生型一氧化氮合酶(iNOS)。比色法检测肠道组织匀浆乳酸含量。以上所有指标检测均按试剂盒说明书进行操作。 五、组织病理学检查 四个组的大鼠在24小时后活杀取标本,留取末端回肠4%福尔马林液固定,经脱水浸蜡包埋,切成3μm薄片,经伊红—苏木紫染色,常规病理学光镜检查,并进行病理评分。 六、电镜超微结构观察 将2.5%戊二醛中固定的样品,投入PH 7.4的PBS(磷酸缓冲液)中漂洗,放入PBS配制的1%OsO4(锇酸)固定液中后固定.乙醇丙酮梯度脱水,环氧树脂EPON812包埋,LKB超薄切片机切片,厚度500A0,铀铅双染色。JEM-100CX透射电镜下观察。 七、统计学分析 用SPSS13.0 For Windows软件处理数据。生化指标和病理评分的数据以均数±标准差((?)±s)表示,采用单因素方差分析(One-Way analysis of Variance,One-WayANOVA)检验,组间比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。 结果 一、肠道组织乳酸含量变化 24小时后休克组、高压氧一次和三次组的肠道组织匀浆乳酸含量均显著高于对照组(P＜0.05),高压氧一次和三次组的肠道组织匀浆乳酸含量均显著低于休克组(P＜0.05)。高压氧三次组低于高压氧一次组,两者间差异不显著(P＞0.05) 二、肠道组织TNF-α含量变化 24小时后休克组、高压氧一次和三次组的肠道组织匀浆TNF-α含量均显著高于对照组(P＜0.05),高压氧一次和三次组的肠道组织匀浆TNF-α含量均显著低于休克组(P＜0.05)。高压氧三次组略低于高压氧一次组,差异不显著(P＞0.05) 三、肠道组织iNOS活性变化 24小时后休克组、高压氧一次和三次组的肠道组织匀浆iNOS活性值均显著高于对照组(P＜0.05),高压氧一次和三次组的肠道组织匀浆iNOS活性值均显著低于休克组(P＜0.05)。高压氧三次组略低于高压氧一次组,两者间差异不显著(P＞0.05) 四、肠道组织NO含量变化 24小时后休克组、高压氧一次和三次组的肠道组织匀浆NO含量均显著高于对照组(P＜0.05),高压氧一次和三次组的肠道组织匀浆NO含量均显著低于休克组(P＜0.05)。高压氧三次组略低于高压氧一次组,两者间差异不显著(P＞0.05)。 五、大鼠肠道组织iNOS活性与NO含量的相关性分析 由表5可见大鼠肠道组织匀浆iNOS活性与NO含量两者之间存在显著的正相关关系(r=0.794,P＜0.001) 六、病理损伤评分 将24小时后处死的大鼠所取得的肠组织病理切片按照Park′s肠损伤评分标准进行评分,结果见表6。对照组的大鼠肠病理损伤评分均显著低于其它三组(P＜0.05),而休克组的大鼠肠病理损伤评分均显著高于高压氧一次和三次组(P＜0.05),高压氧三次组的肠病理损伤评分均低于高压氧一次组,差异不显著(P＞0.05)。 七、电子显微镜亚细胞结构观察 对照组肠黏膜上皮细胞微绒毛规整,无稀疏和断裂及缺损,胞膜完整;细胞质细胞器无减少,线粒体脊无断裂,粗面内质网无扩张;细胞核无肿胀,核周间隙清晰,异染色质常染色质正常;桥粒连接和紧密连接正常。休克组电镜所见:上皮细胞微绒毛脱落消失,紧密连接开放,桥粒连接明显减少,细胞质细胞器减少,线粒体肿胀,脊断裂消失,呈空泡样改变,内质网扩张;细胞核肿胀,呈圆形,核周隙模糊不清,异染色质呈团块状,增多,聚集在核周边。高压氧一次组与高压氧三次组小肠黏膜上皮细胞改变无明显差异,镜下所见:上皮细胞绒毛稀疏,有断裂和缺损,但明显较休克组轻;细胞间连接、细胞器,线粒体等结构损害较对照组为重,但与休克组相比明显减轻;细胞核病理改变明显较休克组减轻。 结论 高压氧可以减少了创伤性休克后肠道组织炎性细胞因子的产生,从而减轻肠道局部的炎症反应。高压氧也能减轻创伤休克肠道组织光镜下的病理变化。高压氧能够明显的减轻创伤性休克复苏后肠道上皮细胞微绒毛、线粒.体、内质网和细胞核发生的一系列的病理损害。高压氧还能够明显减轻创伤性休克复苏后肠道细胞的细胞间连接的损害。这很可能给创伤性休克肠道通透性增加,细菌移位等学说提供有利的证据。很可为创伤休克肠道缺血再灌注损伤机制及高压氧的有效治疗机制提供合理的解释。复苏后24小时内实施三次高压氧与一次高压氧的治疗效果并没有明显的差别。