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《中国医科大学》 2007年
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线粒体功能相关因子在血管平滑肌细胞表型改变中的作用

吴文胜  
【摘要】: 目的 动脉粥样硬化(AS)是冠心病、脑血管意外等心脑血管疾病的病理基础。动脉粥样硬化的发病机理非常复杂,曾有多种学说从不同角度进行探讨,但至今尚未完全明了。目前发现,在各种因素的作用下发生粥样硬化的动脉中,平滑肌细胞表型的改变、增殖和迁移是病理过程的重要环节,转变为合成型后的平滑肌细胞可分泌多种生长因子,使自身和周围细胞大量增殖,并最终导致动脉管腔狭窄,粥样斑块和纤维帽的形成。何种因素启动了平滑肌细胞的表型转化目前仍不十分清楚,可能与多种生长因子、代谢产物等因素有关。研究发现,在平滑肌细胞由收缩型转化为合成型的过程中,一些细胞器,如核糖体、粗面内质网、高尔基体以及线粒体等大量增加,线粒体的增加尤为显著,猜测可能与细胞生长、分裂,以及分泌都需要氧化磷酸化提供大量的能量有关。但线粒体在动脉粥样硬化的形成及平滑肌细胞表型转化过程中的确切作用还不清楚。线粒体在功能改变时,先是线粒体DNA的表达发生转变,这种转变受核基因和线粒体基因共同调控,与其有关的基因很多,目前认为线粒体转录因子A(mtTFA)是线粒体DNA的转录和复制的关键因子,核基因通过调节mtTFA而调控线粒体的功能,启动线粒体内氧化磷酸化过程相关因子的复制、转录和翻译。mtTFA受核呼吸因子(NRF)的调节,有研究表明在寒冷或缺氧的条件下,NRF表达显著增加,同时上调mtTFA,增加线粒体DNA复制,进而增加氧化磷酸化提供能量,以维持细胞的功能。近年来有研究表明,过氧化物酶体增生激活受体γ协同刺激因子(PGC-1)参与细胞内多种物质的代谢过程,可以与多种核受体结合,调节细胞功能。为了能明确线粒体功能在动脉粥样硬化病理发生中的作用,了解其调控的可能机制,我们应用动物模型实验和平滑肌细胞培养实验来探讨可能的病理机制。 方法 一、血管平滑肌细胞表型改变与线粒体功能调节的动物实验研究 1、动物模型建立 雄性健康大耳白兔38只。动物模型建立及分组:将实验兔随机分为4组。正常对照组(C)8只,喂饲基础饲料,实验组(AS模型组)30只,每组10只,喂饲含2%胆固醇,8%猪油,4%蛋黄粉高脂饲料。 2、血液生化指标的测定 实验开始及第4、8、12周末由兔耳缘静脉抽血测血清总胆固醇(TC),甘油三脂(TG),高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)浓度,低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)浓度。指标测定由辽宁中医学院检验科全自动生化分析仪完成。 3、标本取材 实验开始时及第4、8、12周末,分别取实验组8只,取出主动脉,将主动脉纵行剪开,选择主动脉弓处取材。根据不同实验技术和检测指标,取材标本应用不同的方法处理和保存。 4、主动脉血管壁形态学观察 取己用福尔马林固定的主动脉弓标本经石蜡包埋、切片,HE染色镜检观察主动脉动脉病理变化。 5、PGC-1、NRF-1、mtTFA及SMemb的mRNA水平测定(RT-PCR法) 总RNA提取,用紫外分光光度计检测核酸OD值,将原液核酸配成1μg/μl浓度。逆转录反应:PCR仪按94℃2min,94℃40s,57℃40s,72℃1min的条件循环35次,完成PCR反应。 6、PGC-1、NRF-1、mtTFA及SMemb的蛋白水平测定(Western-blot法) 将主动脉新鲜组织块在生理盐水中漂洗后,放入EP管中—70℃保存;实验时,加入相应体积的裂解液,将样品剪碎后匀浆,离心收集上清;取上清10μl,检测蛋白浓度(测OD值);按说明书进行蛋白电泳和转膜。扫描仪扫描印记膜。 二、平滑肌细胞增殖的干预实验 1、细胞培养 人动脉平滑肌细胞加入培养基置于37℃,5%CO2细胞培养箱中培养,每两天换一次液,当细胞长满瓶底80%左右时,用0.1%胰蛋白酶消化传代,第3~10代细胞用于实验。 2、实验分为四组 (1)正常对照组予以常规培养基。(2)oxLDL组,常规培养基中加入oxLDL使其终浓度达到10μg/ml作用24小时(3)棕榈酸组,在(2)组方法的基础上,培养基中加入棕榈酸使其终浓度达到0.75 mmol/l作用24小时。(4)叠氮钠组,在(2)组方法的基础上,培养基中加入叠氮钠使其终浓度达到32mmol/L作用24小时。 3、各组PGC-1、NRF-1及mtTFA的蛋白表达水平检测,应用Western-blot方法。 4、线粒体提取及功能测定线粒体提取功能测定,按试剂盒说明进行操作。 5、MTT染色法检测细胞活性 酶联免疫检测仪下选择波长490nm测定各孔的吸光度值(OD值)。细胞增殖率(%)=(实验组OD值-对照组OD值)/对照组OD值×100%。 6、增殖细胞核抗原PCNA免疫组化检测 SABC法免疫组化检测培养细胞之增殖细胞核抗原PCNA。 结果 一、平滑肌细胞表型改变与线粒体调控相关因子的检测结果 1、实验动物一般状态 实验过程中各组动物同期体重增加无显著性差异(P>0.05)。 2、不同时间的血脂测定结果 随着喂饲高脂饲料的时间延长,动物血清中血脂含量水平呈上升趋势,其中胆固醇、低密度脂蛋白水平浓度增加显著。 3、不同时期动脉内膜与中膜的厚度及内膜与中膜比值 内膜在4W、8W、12W逐渐增厚,中膜在8W、12W增厚,内膜/中膜逐渐增加。 4、PGC-1、NRF-1、mtTFA、SMemb的RT-PCR结果 PGC-1的mRNA表达在4W、8W、12W与喂饲高脂食物前比较差异有显著性(p<0.01),随着时间的延长,其表达呈现上升趋势(p<0.01)。 NRF-1的mRNA表达在4W,与喂高脂食物前比较差异显著性(p<0.01),8W以后其表达趋于平稳,8W和12W与4W比较差异亦有显著性。而8W与12W比较差异无显著性(p>0.05)。 mtTFA的mRNA表达与NRF-1趋于同步升高。 SMemb的mRNA表达随着时间的延长,其表达呈现上升趋势,4个时间段比较,差异均有显著性(p<0.01)。 5、PGC-1、NRF-1、mtTFA、SMemb的Westernblot测定结果 PGC-1的蛋白表达4W、8W、12W与0W比较差异有显著性,其中4W与8W、12W比较差异有显著性(p<0.01),而8W、12W比较差异无显著性(p>0.05)。 NRF-1的蛋白表达在4W与0W比较差异有显著性(p<0.01),8W、12W与0W、4W差异有显著性(p<0.01)。而8W与12W比较差异无显著性(p>0.05)。 mtTFA的蛋白表达在4W与0W比较差异显著性(p<0.05),8W、12W与0W、4W差异有显著性(p<0.05)。而8W与12W比较差异无显著性(p>0.05)。 SMemb蛋白表达随时间延长亦呈现上升趋势,与其mRNA水平改变一致。 二、平滑肌细胞增殖干预与线粒体功能改变的检测结果 1、不同干预因素作用下,PGC-1/NRF-1/mtTFA蛋白水平改变 Ox-LDL组PGC-1、NRF-1、mtTFA蛋白表达增加(p<0.05),棕榈酸组与ox-LDL组比较PGC-1、NRF-1、蛋白表达减少(p<0.05),叠氮钠组与ox-LDL组比较PGC-1、NRF-1、mtTFA蛋白表达是增加的(p<0.05)。 2、不同干预因素作用下,线粒体细胞色素C氧化酶活性改变 Ox-LDL组与对照组比较明显升高(p<0.05),棕榈酸组与oxLDL组比较COX活性降低(p<0.05),叠氮钠组与oxLDL组比较明显降低(p<0.01)。 3、不同干预因素作用下,细胞增殖活性的改变 oxLDL促进细胞增殖(p<0.05),棕榈酸组抑制细胞增殖(p<0.05),应用叠氮钠后可以抑制细胞增殖(p<0.01)。 4、不同干预因素下平滑肌细胞PCNA的检测结果 Ox-LDL组与对照组比较,PCNA蛋白表达明显增强(p<0.05),棕榈酸组、叠氮钠组PCNA蛋白表达均明显减弱,与ox-LDL组比较差异有显著性(p<0.01)。 结论 动脉中膜平滑肌细胞表型由收缩型变为合成型在粥样硬化的形成中起着重要的作用。 1、在本实验中平滑肌细胞表型转变过程中,NRF-1的表达也在逐渐升高,与mtTFA成明显正相关。二者的表达增高和相互作用,共同调节线粒体功能,在平滑肌细胞表型改变中起着重要作用。 2、随着平滑肌表型的改变,合成型平滑肌细胞不断增加,PGC-1也随着增加,并且与NRF-1成正相关,针对PGC-1的干预同样下调了NRF-1,说明二者存在内在的联系。在动脉粥样硬化过程中可能是PGC-1启动了NRF-1,导致NRF-1增加,进而启动了mtTFA从而导致mtDNA转录、复制加强,平滑肌细胞线粒体增加。 3、由此推测平滑肌细胞表型改变过程中,PGC-NRF-mtTFA途径存在并起着重要作用。
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R543

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