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糖尿病大鼠视网膜组织CTGF、VEGF、TGF-β_2作用机制和CTGFsiRNA的干预作用

杨宏伟  
【摘要】: 研究背景和目的 糖尿病性视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是最严重和常见的糖尿病并发症之一,是50岁以上人群的重要致盲眼病。近年来糖尿病的发病率显著上升,其中在发展中国家的增长速度要远大于其他国家。其发病率高达38%~90%,现已引起人们广泛重视。糖尿病因糖代谢障碍致全身各组织器官的微血管异常,在眼部可引起视网膜缺血缺氧,新生血管形成,纤维增殖等以致视网膜脱离,甚至导致丧失视失。DR的发病机制十分复杂,至今尚未完全阐明。细胞因子在DR的发生、发展中起重要作用。其中新近发现的结缔组织生长因子(connective tissuegrowth factor,CTGF)引起了许多学者的关注,CTGF为CCN(CTGF/fisp12,Cef10/cry61,Nov,CCN)家族成员之一,为单体分泌性多肽。CTGF广泛存在于人类多种组织器官中,它具有促进血管生成、调节内皮细胞、诱导细胞凋亡,促进有丝分裂和细胞增生,趋化细胞等作用。近年来的研究显示CTGF参与了糖尿病视网膜病变的发病机制。与CTGF密切相关的细胞因子包括血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor VEGF)和转化生长因子(transforming growthfactor,TGF)等,它们在CTGF的作用过程中也发挥着重要的作用。研究显示,CTGF蛋白可与VEGF蛋白连接,相互作用影响新生血管形成;同时CTGF被认为是TGF-β_2的下游效应介质;TGF-β_2可诱导CTGF和VEGF表达增加;TGF-β_2可通过MAPK和PKC途径使VEGF表达增加。另外,细胞凋亡在糖尿病视网膜病变的发生发展中起了很重要的作用。细胞凋亡存在于糖尿病视网膜的神经节细胞层,光感受器细胞层和内核层。在糖尿病患者中,视网膜内细胞凋亡的程度明显高于非糖尿病者。多元醇通路的激活,山梨糖醇聚集可影响视网膜的功能,氧化损伤、糖基化终产物的形成可能对视网膜产生毒性作用,通过非酶糖基化途径诱导视网膜细胞凋亡。RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术是一种转录后基因沉默的强大工具,已证实其为化学合成长21~23个核苷酸的小分子RNA(smallinterfered RNA,siRNA),能在哺乳动物体内外介导同源基因沉默。siRNA作为一种新方法可以用来研究在各种组织中基因产物的功能。总之,到目前为此,虽然取得了诸多的进展,但各因子间的关系并不十分清楚,DR还是严重威胁人们视力的疾病,也不能完全地预防及治疗,因此需要进一步对其进行研究。对三种细胞因子的深入研究,有利于破解糖尿病视网膜中微血管病变的发生机制。本实验以CTGF为主线,利用CTGF小干扰RNA技术的干预,通过检测糖尿病大鼠视网膜中CTGF、VEGF和TGF-β_2蛋白和基因的表达,细胞凋亡的发生情况,来分析三因子在糖尿病大鼠视网膜中的作用机制,以求寻找到防治DR的新策略。 方法 利用STZ诱导形成糖尿病大鼠模型。Wistar大鼠,体重为180-220g,240只。腹腔注射1%STZ溶液,剂量为60mg/kg。连续三天尿糖在+++以上,72小时后取大鼠尾静脉检测血糖,血糖值大于16.7mmol/L,为糖尿病大鼠造模成功。所有大鼠分为对照组,糖尿病4周、8周、12周、16周、24周组和干预组(糖尿病16周)。干预组为糖尿病16周时给予CTGFsiRNA玻璃体腔注射。 视网膜铺片ADP酶染色观察视网膜血管形态,HE染色光镜下观察视网膜各层结构。应用RT-PCR和Western-Blot方法检测视网膜内CTGF、VEGF和TGF-β_2基因和蛋白的表达;免疫组化观察以上三因子在视网膜内的分布情况。应用TUNEL方法检测视网膜内细胞凋亡的表达。 统计学分析:统计结果均以均数士标准差表示,应用SPSS10.0软件进行统计分析,包括两组资料之间比较的t检验和相关分析。 结果 成功建立了STZ诱导糖尿病大鼠模型。成功率为97.50%。在糖尿病16周以前,视网膜结构规则,血管走行良好与对照组无显著差异。到24周时,可见视网膜结构不规则,水肿,细胞排列紊乱,有部分细胞突出于内界膜;视网膜血管主干较为僵硬变窄,但未见缺血区及新生血管形成。细胞凋亡表达在糖尿病4周就已出现,并逐渐增强。CTGF,VEGF和TGF-β_2的表达水平在糖尿病视网膜内明显增强。CTGF开始于糖尿病8周,主要位于视网膜神经节细胞层;VEGF和TGF-β_2则在糖尿病12周时开始表达增强,CTGF的表达增强早于VEGF和TGF-β_2;差异具有统计学意义(P<0.05),随着病程的延长,三因子的表达逐渐增强;到糖尿病24周时,三因子均达到表达均最强,在视网膜各层均可见免疫染色的蛋白。CTGFsiRNA在干预组大鼠视网膜内造成了CTGF基因的沉默,干扰效率为54.46%,CTGF蛋白的干扰效率为45.11%,同时也使VEGF、TGF-β_2 mRNA及其蛋白表达明显减弱,细胞凋亡表达也明显减少,统计学上差异具有显著性意义(P<0.05)。我们发现在糖尿病早期大鼠视网膜内CTGF与VEGF(P<0.05),CTGF与TGF-β_2(P<0.05),VEGF与TGF-β_2(P<0.01)之间,以及三种因子与细胞凋亡的表达(P<0.01)之间呈明显的正相关性。 结论 本研究成功建立了糖尿病大鼠模型,在糖尿病早期视网膜内可见血管及网膜的结构无明显改变,但出现了逐渐增多的凋亡细胞,最早发生在视网膜神经节细胞层,之后出现于内核层及外核层,到糖尿病24周时出现视网膜血管变窄及僵硬,网膜水肿及细胞排列不规则等病变。这表明糖尿病早期视网膜细胞凋亡的发生要早于血管病变的发生。糖尿病可促使大鼠视网膜内的CTGF表达增强,同时也上调了视网膜内VEGF和TGF-β_2的表达,并参与了视网膜细胞凋亡的诱导。CTGF的表达增强的发生早于VEGF和TGF-β_2的表达。说明CTGF在三因子的相互作用中占了主要地位。CTGFsiRNA沉默了CTGF基因的表达,使VEGF、TGF-β_2蛋白和基因表达也明显下降,并使糖尿病视网膜内的细胞凋亡表达出现减弱趋势。总之,CTGF,VEGF和TGF-β_2三者在糖尿病早期视网膜中发挥了重要作用。CTGFsiRNA有可能为临床提供一个预防和治疗DR的新策略。


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