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《中国医科大学》 2009年
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妊娠期母体亚临床甲减对后代智力和脑发育相关基因表达影响的动物实验研究

刘迪杰  
【摘要】: 目的 甲状腺激素对于中枢神经系统的分化和发育具有十分广泛而显著的影响,胎儿期和出生后早期甲状腺激素缺乏将造成不可逆的脑损伤,引起严重的感觉、运动障碍和智力低下,其发病时间、严重程度及开始甲状腺激素治疗的时间等因素均与脑损害的发生和恢复密切相关。造成胎儿甲状腺激素缺乏的原因包括妊娠期母体甲状腺激素的减少如甲状腺功能减退症(甲减)、胎儿甲状腺激素减少如先天性甲状腺缺如以及因妊娠期碘缺乏导致的母体和胎儿甲状腺激素均减少。母体临床甲减及碘缺乏对胎儿和后代智力的影响已经明确。妊娠期母体亚临床甲减导致后代智力障碍目前已有数篇报导。妊娠期母体亚临床甲减的患病率为2%~3%,如此庞大的女性患病人群存在,提示甲状腺激素缺乏带来胎儿第一阶段脑发育影响的普遍性和重要性。但是母体亚临床甲减对后代脑发育影响的机制研究尚未见报道。本实验在成功建立亚临床甲减孕鼠动物模型的基础上,观察母鼠亚临床甲减对仔鼠行为学改变的影响,并从脑发育相关基因表达方面探讨母体亚临床甲减导致的胎儿脑发育障碍的机制。 方法 60只SPF级雌性Wistar大鼠随机分成3组(每组n=20)。①正常对照组:行假手术、皮下等量注射生理盐水,作为阴性对照;②亚临床甲减组:手术切除甲状腺,于背部皮下植入微渗泵(osmotic minipump),泵中的L-T4以1.0μg/(100g·d)浓度持续泵入,当血清TSH高于正常、但TT_4水平在正常范围时,提示亚临床甲减鼠建模成功。十天后与正常的雄鼠合笼交配,雌鼠镜下阴道涂片发现精子确定为妊娠0天,记为E0。自E15天后L-T4剂量调整为1.05μg/(100g·d)持续泵入至仔鼠生后10d,将分娩当日定为P0天;③完全甲减组:阳性对照组、手术完全切除甲状腺,皮下等量注射生理盐水,作为阳性对照。母鼠于E10、E13、E17、P1时眶后静脉丛取血,测定血清TSH、TT_4。仔鼠出生后P3、P7、P21冰上断头取海马组织,以Real-time PCR方法检测BDNF、NCAM mRNA表达量,以Westernblot方法检测BDNF、Rap1蛋白表达量,并与同日龄对照组比较。仔鼠出生后P35断头取脑,以HE染色、尼氏染色方法观察亚临床甲减仔鼠脑病理改变及神经细胞形态学改变,仔鼠出生后P40行Morris水迷宫行为学检测并与同日龄对照组比较。应用SPSS12.0软件处理和分析数据。 结果 1、亚临床甲减孕鼠模型的制备:孕鼠血清TSH、TT_4水平结果显示:与假手术组比较,各孕龄(E10、E13、E17、P1)亚临床甲减组表现为血清TT_4水平未见明显改变,而TSH水平明显升高(P<0.05);与完全甲减组比较,各孕龄亚临床甲减组表现为血清TT_4水平明显升高,TSH水平明显降低(P<0.05),符合亚临床甲减激素血清学改变。 2、亚临床甲减孕鼠后代发育及激素水平:正常对照组仔鼠活动好,体重增加快,毛发发育正常;亚临床甲减组仔鼠各方面未见明显异常;甲减组仔鼠睁眼较对照组迟3~5天,体形偏小,尾短,行动迟缓,步态不稳,毛发出现迟缓且稀疏,体重增加缓慢,明显低于正常对照(1日龄P>0.05,21日龄P<0.01)。40日龄进行Morris水迷宫测试时,亚临床甲减仔鼠血清激素水平和对照组无统计学差异;完全甲减组仔鼠体重低,血清TT_4水平显著低于同日龄对照组(P<0.01),TSH较同日龄对照明显升高(P<0.01)。 3、Morris水迷宫行为测定结果:定位航行试验中,随着训练次数的增加,各组的逃避潜伏期总的趋势是不断缩短,第9次训练结束,即学习训练结束时,对照组逃避潜伏期为18.23±4.27s,亚临床甲减组为35.63±5.95s,甲减组为55.16±5.15s,组间逃避潜伏期比较有显著性差异(P<0.05)。空间搜索试验中,在P44(撤离平台当日)时,正常对照组仔鼠在靶象限内游泳的时间明显长于其它象限,亚临床甲减组仔鼠在靶象限内游泳的时间也长于其它象限,与对照组比较无显著性差异(P>0.05),而完全甲减组仔鼠,在各个象限内游泳的时间差别不明显,与对照组比较有显著性差异(P<0.01)。在P49天(撤离平台24h后),空间探索测量大鼠的长时空间记忆能力实验中,正常对照组仔鼠在靶象限内游泳的时间仍明显长于其它象限,而亚临床甲减组仔鼠在靶象限内游泳的时间与其它象限游泳时间无明显差异,与对照组比较有显著性差异(P<0.05)。完全甲减组后代,在各个象限内游泳的时间差别仍不明显,与对照组比较有显著性差异(P<0.05)。 4、亚临床甲减组仔鼠海马CA1区HE染色可见神经细胞排列较整齐,层次较清楚,无核固缩,其细胞形态同正常对照组仔鼠相比无明显差异;亚临床甲减组仔鼠海马尼氏小体染色的平均光密度、积分光密度低于正常对照组(P<0.05),但是,明显多于完全甲减组(P<0.01)。 5、用实时定量PCR方法测定海马组织的BDNF mRNA水平结果显示,与正常对照组仔鼠相比,亚临床甲减组仔鼠在出生后3d海马BDNF mRNA表达量下降约0.73倍,差异有统计学意义(P<0.05),出生后7d、21d海马BDNF mRNA表达量与正常对照组间无显著差异(P>0.05);甲减组仔鼠海马BDNF mRNA表达量3d、7d和21d均明显低于亚临床甲减组和对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。与正常对照组仔鼠相比,亚甲减组仔鼠在出生后3d、7d及21d海马NCAM mRNA表达量有升高的趋势,但差异无显著性(P>0.05);与亚临床甲减组和对照组比较,甲减组仔鼠海马NCAM mRNA表达量在3d、7d和21d均明显升高(P<0.01)。 6、用Western印迹法测定仔鼠海马组织的BDNF、Rap1蛋白水平。检测结果显示,与正常对照组比较,亚临床甲减组仔鼠海马BDNF蛋白表达量在仔鼠出生后3d、7d明显降低,降低幅度分别为33%(P<0.01)、29%(P<0.05)。21d时与正常对照组差异无统计学意义(P>0.05);与亚临床甲减组和对照组比较,完全甲减组仔鼠海马BDNF蛋白的表达量在各时间点均明显下降(均P<0.01)。与正常对照组比较,亚临床甲减组后代仔鼠海马内Rap1蛋白表达量在出生后7d时出现显著升高,升高幅度为42%(P<0.05),21d时继续升高,升高幅度为59%(P<0.01);与亚临床甲减组和对照组比较,完全甲减组仔鼠海马Rap1蛋白的表达量在3d时即出现升高,升高幅度为20%(P>0.05),7d和21d继续升高,分别升高42%、58%,差异有统计学意义(均P<0.05)。 结论 1、通过手术切除甲状腺,于背部皮下植入L-T4微渗泵,孕前至E15天L-T4剂量1.0μg/(100g·d),E15天后L-T4剂量1.05μg/(100g·d)持续泵入至仔鼠生后10d,能够成功建立亚临床甲减孕鼠模型。模型稳定,为后部分的研究工作奠定了基础。 2、妊娠期亚临床甲减仔鼠出生后P35海马尼氏小体染色的平均光密度、积分光密度均明显减少。通过Morris水迷宫的行为学实验指标,从不同角度验证了不仅母体甲减可以导致后代学习记忆能力的减低,母体亚临床甲减也可以导致仔鼠的空间学习记忆能力受损。 3、妊娠期亚临床甲减孕鼠能引起后代仔鼠出生后早期(P3)大脑海马DBNFmRNA表达水平下降,P3、P7 BDNF蛋白水平表达下降;P7和P21大脑海马Rap1蛋白表达水平增加,表明二者共同参与了妊娠期母体亚临床甲减对后代学习记忆功能的损伤。
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R581.2;R714.2

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