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《中国医科大学》 2009年
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自发性癫痫大鼠海马电压门控性钠通道的表达研究

郭凤  
【摘要】: 前言 电压门控性钠通道为一种跨膜的糖蛋白,其在神经元动作电位的产生与传播过程中发挥重要作用。在中枢神经系统中,钠通道通常由一个α型大亚基(260KD)和一个或多个β型小亚基(32~37KD)组成,其结构均由四个有50%序列同源的结构域(Ⅰ~Ⅳ)组成,每个结构域含有6个跨膜片段(S_1~S_6)。研究表明α型大亚基与β型小亚基均具有对钠通道失活与激活动力学的调节作用;此外β型小亚基可以作为细胞黏附因子来发挥调节作用。 哺乳动物的α型大亚基根据不同的组织特异性与生物物理学特性由9个基因编码。中枢神经系统中,Nav1.1、Nav1.2、Nav1.3和Nav1.6表达较多,其中Nav1.1在海马、小脑、脊髓、脑干等部位表达很高。已有钠通道的200多种基因突变在不同癫痫表型的研究中被证实。伴热惊厥性全身性癫痫(Generalized epilepsy withfebrile seizure plus,GEFS~+)是一种常染色体显性遗传的特发性全身性癫痫,SCN1A(编码Nav1.1的基因)和SCN1B(编码β_1的基因)的突变可引起GEFS~+。Nav1.3的mRNA在癫痫患者的海马CA4区表达显著升高;而对于癫痫持续状态诱发后4小时的新生鼠,Nav1.3的mRNA在其海马CA1、CA3区以及齿状回颗粒细胞区表达上调。因此,以往很多研究均表明电压门控性钠通道的遗传异常表达可能会引起中枢神经系统神经元的兴奋性变化。 自发性癫痫大鼠(Spontaneously epileptic rat,SER)是一种纯合型的双基因突变大鼠:其突变基因tm来自于东京Wistar大鼠突变系Tremor,突变基因zi来自于德国斯普拉格——道利鼠突变系Zitter,两种突变基因均为常染色体隐性遗传。出生后8周,SER自发性地出现癫痫大发作和失神样的小发作,其脑电图典型表现为皮质与海马区出现的5~7赫兹的棘慢复合波。到目前为止,SER被认为是研究人类癫痫最好的动物模型之一,抗癫痫药物对SER的治疗作用反应与对人类癫痫作用十分相近。有报道利用SER进行有关改善天冬氨酸酰酶的基因治疗;而涉及离子通道病方面,仅报道了SER电压门控性钙通道的功能变化。 然而,迄今为止,有关SER电压门控钠通道的研究仍为空白。在本研究中,我们假设SER在其遗传性癫痫发生发展中涉及到钠通道的参与与变化。因此,我们拟从基因与蛋白两个层面研究SER电压门控性钠通道的表达情况,以期明确其在癫痫海马兴奋性中的角色与作用。 实验材料和方法 1、材料 动物、试剂与仪器:健康SER和正常Wistar大鼠9~12周龄,每个实验组均为6只;Wistar新生鼠5只,均小于一周龄;雌雄不限,均由中国医科大学实验动物部提供。Trizol(GIBCO BRL),免疫组化SP试剂盒(北京中山公司),实时定量RT-PCR试剂盒(Takara),引物由上海生工生物工程公司合成,其他药物均为国产分析纯。Ⅰ型与Ⅲ型钠通道亚基兔多克隆抗体(anti-Nav1.1,anti-Nav1.3,Sigma),anti-β_(1ex)由密歇根大学Lori L.Isom博士赠送;CM1800 LEICA冰冻切片机(德国),PCR仪(PE-9600,PE-2400),凝胶自动成像仪(美国,GDSH型),MetaMor2ph/DP10/BX41图像分析系统(美国)。 2、方法 RT-PCR分析:总的RNA从SER与正常Wistar大鼠整个海马组织中提取,参照Takara试剂盒进行实时定量RT-PCR操作。目的基因Nav1.1、Nav1.3和β_1亚基mRNA的相对表达水平用目的基因与管家基因的平均光密度比值确定。 实时定量RT-PCR分析:总的RNA从SER与正常Wistar大鼠整个海马组织中提取,参照Takara试剂盒进行实时定量RT-PCR操作。目的基因七点标准曲线通过反转录产物五倍稀释物进行。目的基因Nav1.1、Nav1.3和β_1亚基mRNA的相对表达水平用目的基因与管家基因的拷贝数比值确定。 免疫荧光分析:SER组、正常对照组与新生鼠组(阳性对照)腹腔麻醉后快速取出鼠脑,常规制作冰冻切片。钠通道亚基兔多克隆抗体一抗(anti-Nav1.1,1:25稀释;anti-β_(1ex),1:100稀释;anti-Nav1.3,1:25稀释)常温30分钟后4℃过夜,用FITC标记的羊抗兔二抗孵育切片,PBS漂洗三次后,荧光显微镜观察。 免疫组化分析:SER组与正常组常规做石蜡切片。钠通道亚基兔多克隆一抗(anti-β_(1ex),1:100稀释;anti-Nav1.1,1:25稀释)孵育切片,常温30分钟后4℃过夜。用针对一抗的生物素标记的羊抗兔二抗孵育切片,37℃1小时。DAB显色后,用苏木精做核复染。每只大鼠取10张脑片,其断面水平各鼠均相似,所有脑片均在同一放大倍数(×400)、同一光强度下分析。首先分析海马内平均阳性细胞数,然后用MetaMorph/DP10/BX41图像分析系统测定各组海马CA1、CA3与齿状回蛋白阳性反应物的平均灰度值。 免疫印迹分析:SER组、正常对照组与新生鼠组(阳性对照)腹腔麻醉后快速取出鼠海马,提取总蛋白。考马斯亮蓝法测蛋白浓度,上样后进行SDS-PAGE蛋白电泳,一抗(anti-β_(1ex),1:500稀释;anti-Nav1.1,1:200稀释;anti-Nav1.3,1:200稀释)孵育。ECL与DAB显影。 统计学分析:各组结果以平均值±标准差表示,两组间比较用t检验。 结果 1、RT-PCR结果显示:SER海马Nav1.1 mRNA的表达显著高于正常对照组(1.14±0.16 in SERs vs 0.68±0.11 in control rats;p<0.001);SER海马Nav1.3mRNA的表达亦显著高于正常对照组(0.89±0.17 in SERs vs 0.45±0.16 in controlrats;p<0.001);同样的,SER海马β_1亚基mRNA的表达显著高于正常对照组(1.12±0.11 in SERs vs 0.91±0.14 in control rats;p<0.05)。 2、实时定量RT-PCR结果显示:SER海马Nav1.1 mRNA的表达显著高于正常对照组(1.01±0.37 in SERs vs 0.36±0.11 in control rats;p<0.001);SER海马Nav1.3mRNA的表达亦显著高于正常对照组(0.55±0.15 in SERs vs 0.39±0.15 in controlrats;p<0.001);同样的,SER海马β_1亚基mRNA的表达显著高于正常对照组(0.62±0.13 in SERs vs 0.52±0.07 in control rats;p<0.05)。综上,SER海马Nav1.1、Nav1.3和β_1亚基在mRNA水平表达上调。 3、免疫荧光结果显示:Nav1.1和β_1亚基蛋白在SER和正常大鼠海马各区均有表达;Nav1.3蛋白在新生鼠(三天龄,阳性对照)海马有表达;然而,在正常对照大鼠中未见显著表达Nav1.3蛋白的阳性细胞;值得注意的是,正常对照大鼠微量表达的Nav1.3蛋白在SER海马有显著的阳性表达。 4、免疫组化结果证实:Nav1.1和β_1亚基蛋白免疫反应性的阳性细胞在SER和正常大鼠海马各区均有表达,包括CA1、CA3以及齿状回颗粒细胞区;SER海马各区Nav1.1和β_1亚基蛋白免疫反应性的阳性细胞数和平均灰度值均显著高于正常对照大鼠,提示SER海马各区Nav1.1和β_1亚基蛋白表达上调。 5、免疫印迹结果进一步证实:SER海马Nav1.1蛋白表达显著高于正常对照组(0.52±0.05 in SERs vs 0.30±0.04 in controlrats;p<0.001);SER海马Nav1.3蛋白表达亦显著高于正常对照组(0.38±0.07 in SERs vs 0.17±0.05 in control rats;p<0.001);然而,SER海马Nav1.3蛋白表达与新生鼠阳性对照组无统计学差异(0.38±0.07 in SERs vs 0.37±0.05 in neonatal rats;p>0.05);SER海马β_1亚基蛋白的表达亦显著高于正常对照组(0.40±0.06 in SERs vs 0.29±0.05 in control rats;p<0.05)。综上,SER海马Nav1.1、Nav1.3和β_1亚基在蛋白水平表达上调。 结论 1、首次证实,与正常Wistar大鼠比较,SER海马Nav1.1、Nav1.3和β_1亚基在mRNA水平表达上调。 2、首次发现,Nav1.1和β_1蛋白在SER海马各区均有表达,包括CA1、CA3以及齿状回颗粒细胞区。 3、首次证实,与正常Wistar大鼠比较,SER海马Nav1.1和β_1亚基在蛋白水平表达上调。 4、首次发现,正常成熟的Wistar大鼠微量表达的Nav1.3蛋白在成熟的SER海马有显著的阳性表达。 5、SER海马Nav1.1、Nav1.3和β_1亚基在mRNA与蛋白水平表达上调,可能会促进癫痫样兴奋活动的产生,进而构成SER癫痫表型的发作基础。 6、SER作为一种良好的癫痫动物模型,可用其筛选钠通道特异性亚型与亚基药物并应用于基因治疗。 7、本研究结果在解释遗传性癫痫海马兴奋性的分子机制上有其重要意义。
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R742.1

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