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《中国医科大学》 2009年
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檀香油对中波紫外线引起人体皮肤光损伤的防护作用

徐宏慧  
【摘要】: 前言 皮肤是被覆于人体表面的器官,与外界环境直接接触。皮肤具有复杂的抗氧化功能,决定氧化应激造成的损伤程度。皮肤的自然老化及外源性刺激可以使自身的抗氧化能力下降。紫外线(ultraviolet,UV)照射是引起皮肤抗氧化能力下降的一个因素。过度的UV照射造成细胞内活性氧基团增加,损伤皮肤内的脂质、蛋白和核酸,皮肤会出现红斑、水肿、增生、光老化、色素沉着、DNA损伤及免疫抑制,这些生物反应直接或间接地导致皮肤肿瘤的发生。近年来,由于人们生活方式的改变、户外活动增加以及大气臭氧层的破坏,由UV引起的疾病不断增多。 动物和人体实验表明天然抗氧化剂如维生素C和E、大豆异黄酮、绿茶多酚、白藜芦醇及N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcystein,NAC)等能调节这些事件的启动和进展,减轻UV引起的皮肤损伤。这些提示在护肽品中或饮食中加入抗氧化剂可能阻止UV引起的皮肤炎症、老化,抑制肿瘤发生。但是,有些抗氧化剂如维生素C和E很不稳定,而有些如NAC要很高浓度才能起作用,而且,每种抗氧化剂都不能完全消除UV引起的光损伤。所以,有必要探索新的抗氧化剂,以增强抗光损伤的功效。 檀香油(sandalwood oil)又名东印度檀香油,由檀香科植物白檀的木片或根、枝经水蒸气蒸馏所得。檀香油用于治疗炎症性皮肤病及皮肤护理已有数千年的历史。外用檀香油具有很强的杀菌效果,能抑制痤疮丙酸杆菌、皮肤癣菌的生长,抑制单纯疱疹病毒1型复制,并且对宿主细胞无细胞毒作用。它能刺激细胞的更新,有助于瘢痕、伤口、皱纹、痤疮以及其他皮肤病的愈合。因其疗效卓著,被称作“液体黄金”。檀香油能清除活性氧基团,有很强的抗氧化作用。 Dwivedi等报道檀香油及其主要成分α-檀香醇涂抹小鼠皮肤后,能显著抑制化学致癌剂致皮肤肿瘤的启动和促进,减少肿瘤的数目。α-檀香醇亦能诱导人类表皮样细胞癌A431细胞凋亡。我们预期人体皮肤局部涂抹檀香油可以减轻UV照射引起的皮肤光损伤。但目前人体应用檀香油的有效性及安全性尚无报道。 本研究的目的是通过在人体皮肤UVB照射前、后涂抹檀香油,比较出现红斑和不适反应程度、表皮内日晒伤细胞数目,分析基质金属蛋白酶-1(matrixmetalloproteinase,MMP-1)和MMP-9、白介素-10(interleukin-10,IL-10)和表皮内朗格汉斯细胞(Langerhans cells,LCs)数目及p53的表达等指标,来探讨局部涂抹檀香油对UVB引起的人体皮肤晒伤、光老化、光免疫抑制及光致癌性有无防护作用。 方法 1、志愿者: 30名健康女性(年龄42~50岁,Fitzpatrick皮肤类型Ⅲ~Ⅳ型),未患与光线有关的皮肤病,没有系统疾病;试验部位没有皮肤病;1个月内及实验过程中没有用药(包括非处方药)。签署知情同意书。其中15名取皮肤活检。 2、最小红斑量(minimal erythema dose,MED)测定 实验前测定每个志愿者的MED。在背部或臀部选择8个部位,分别以不同剂量UVB照射,以出现红斑的最小UVB剂量作为MED。 3、UVB照射及檀香油涂抹: 选择背部作为照射区域。UVB照射剂量为1.5-MED。分别于照射UVB前1小时或照射后5分钟涂抹1%檀香油、5%檀香油(溶于基质3:2的丙二醇:乙醇中)或基质;仅照射UVB、仅涂抹5%檀香油及不涂抹檀香油也不照射UVB作为对照。每个部位涂抹50μl檀香油溶液。照射UVB前将溶液轻轻擦去。 4、红斑程度: 红斑程度分级:0:无红斑;1:淡红斑;2:明显红斑;3:显著红斑或有浸润。照射后24小时由2名医生独立评估、照相。 5、测定红斑指数(erythema index,EI): 分别于照射前、照射后24小时及7天后测定各部位的红斑指数,每个部位测5个点,取平均值作为该点的E_I0、EI_(24h)、EI_(7d)。 6、不适指数: 采用5分法进行评分:正常皮肤感觉—1;轻度瘙痒—2;明显瘙痒—3;轻度疼痛—4;明显疼痛—5。 7、皮肤活检: 15例志愿者照射后24小时实验区域取皮肤活检,每块分成3~4份:分别福尔马林固定后石蜡包埋、OCT包埋-70℃冻存、立即浸于液氮中数秒后-70℃冻存、EDTA中浸泡4℃过夜后分离表皮。 8、石蜡切片苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色: 4μm厚石蜡切片贴于挂有多聚赖氨酸的载玻片上,HE染色。显微镜下观察表皮内日晒伤细胞,照相,计数400倍镜下5个视野内日晒伤细胞数目。计算15例志愿者的平均值±标准差。 9、免疫组化:所有抗体都是小鼠抗人单克隆抗体 (1)冰冻切片中MMP-1、MMP-9:抗体1:50稀释。 (2)石蜡切片中p53表达:抗体1:100稀释。 (3)新鲜表皮片中CD1a表达:解剖显微镜下分离表皮,置于Eppendorf管中与抗体反应。 10、荧光Real-time定量RT-PCR检测皮肤活检中MMP-1、MMP-9mRNA水平 -70℃冻存的组织块切片后应用RNAiso试剂盒提取总RNA,应用紫外分光光度计测定浓度和纯度,反转录,得到cDNA,荧光real-time quantitative PCR扩增。根据RNA浓度,反转录体系中加入的RNA模板量调至相同,以使得到的cDNA量一致。根据各样本内参照β-actin,对mRNA进行半定量分析。 11、RT-PCR检测皮肤活检中IL-10 mRNA水平 -70℃冻存的组织块切片后应用RNAiso试剂盒提取总RNA,测定浓度和纯度。根据RNA浓度,反转录体系中加入的RNA模板量调至相同,以使得到的cDNA量一致。PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳。用Labworks 4.0软件分析电泳条带,以IL-10与内参照GAPDH条带的密度比值表示IL-10 mRNA相对量。 12、统计学分析: 应用SPSS 13.0统计软件包进行ANOVA方差分析,以P<0.05有统计学意义。 结果 1、红斑程度: 30名受试者UVB照射的部位均出现了不同程度的红斑,涂抹檀香油照射UVB的部位红斑程度都减轻,5%檀香油防护效果强于1%檀香油。空白对照及仅涂抹檀香油的部位均无红斑出现。 2、EI: UVB照射后24小时各部位照射EI值与肉眼观察的红斑程度一致。涂抹檀香油的部位EI值明显低于UVB照射及UVB/基质的部位。7天后,照射部位遗留色素沉着斑,红斑几乎消退,红斑指数下降,但仍显著高于照射前(P>0.05)。 3、不适指数: 除空白对照及仅涂抹檀香油的部位无任何不适外,其余各处均有不同程度的瘙痒,2名志愿者仅UVB照射的部位及UVB/基质部位出现轻度疼痛。涂抹檀香油的部位不适指数为1者居多,5%檀香油的作用略强于1%檀香油。 4、日晒伤细胞: UVB照射后表皮内出现日晒伤细胞,表现为胞核浓缩,胞浆嗜伊红染色。涂抹檀香油的部位表皮内日晒伤细胞数显著少于UVB/基质及仪照射UVB的部位(P<0.05),5%檀香油的作用强于1%檀香油(P<0.05),UVB照射前、后涂抹檀香油的作用没有显著性差异(P>0.05)。 5、MMP-1、MMP-9蛋白的表达: UVB照射后MMP-1、MMP-9的表达增加,檀香油涂抹对UVB引起MMP-1、MMP-9蛋白表达增高有抑制作用。涂抹檀香油的部位真皮内MMP-1、MMP-9表达量显著少于仅照射UVB的部位(P<0.05),与空白对照间差异很小(P>0.05)。照射前、后涂抹檀香油的作用没有显著性差异。 6、MMP-1、MMP-9 mRNA水平: UVB照射及UVB/基质的部位照射24小时后皮肤活检组织中MMP-1、MMP-9mRNA水平较空白对照部位显著升高(P<0.05),UVB照射前、后涂抹檀香油可以抑制MMP-1、MMP-9 mRNA水平(P<0.05),涂抹5%檀香油/UVB的部位mRNA水平与空白对照皮肤中接近(P>0.05)。 7、表皮片中CD1a~+LCs数目: UVB照射24小时后,UVB及UVB/基质部位表皮片中CD1a~+LCs较空白处显著减少(P<0.05)。UVB照射前、后涂抹檀香油可以抑制UVB减少表皮内LCs的作用(P<0.05)。涂抹5%檀香油/UVB的部位表皮片中LCs数量与空白对照表皮中相当(P>0.05)。 8、IL-10 mRNA水平: 人体皮肤照射1.5-MED的UVB 24小时后,UVB与UVB/基质部位皮肤活检中IL-10 mRNA水平较正常皮肤中显著升高(P<0.05)。檀香油抑制UVB诱导的IL-10mRNA的升高,5%檀香油作用强于1%檀香油(P<0.05)。 9、p53的表达: 空白对照部位个别角质形成细胞核p53染色阳性,与UVB照射部位有显著性差异。涂抹基质前、后照射UVB部位p53阳性细胞数与仅UVB照射部位无明显差异。涂抹5%檀香油/UVB部位表皮内p53阳性细胞数显著少于仅UVB照射及UVB/基质部位(P<0.05)。 结论 1、人体皮肤涂抹檀香油可以减轻UVB照射引起的皮肤红斑与不适,减少表皮内日晒伤细胞的形成。人体皮肤涂抹檀香油没有刺激性及过敏反应,安全性好。 2、人体皮肤涂抹5%檀香油能抑制UVB照射引起的MMP-1和MMP-9mRNA及蛋白表达的升高,从而抑制光老化。 3、人体皮肤照射UVB引起表皮内LCs数目减少及IL-10 mRNA水平升高,局部涂抹檀香油能保护表皮内的LCs,抑制IL-10水平升高,从而保护皮肤正常的免疫功能。 4、人体皮肤局部涂抹檀香油能够抑制UVB引起的p53表达,在人体皮肤中具有抗光致癌的作用。 5、UVB照射前、后涂抹檀香油有相同的功效,提示檀香油的光防护作用不是通过遮光起作用的。
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R275

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