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《中国医科大学》 2009年
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应用PCR-SSCP和PCR-RFLP方法分析线粒体DNA多态性及其法医学应用的研究

张明阳  
【摘要】: 前言 国内外法医实验室采用的DNA遗传标记分为两大类:核基因组DNA和线粒体DNA(mtDNA)。与细胞核DNA相比,mtDNA有许多无法比拟的优点,如拷贝数高、对样木质量要求不高、对样木需求量低。这此特点非常适合用于细胞数量极少或严重降解的法庭科学生物样本,如骨骼、毛发、指甲、微量血痕等分析。因此在法医学领域,mtDNA的应用日益广泛。此外,除了满足法医物证学个体识别和亲缘关系鉴定这两项基本要求外,它已经越来越多的应用于法庭科学的各个方面。 近年来,mtDNA的研究不断深入,线粒体DNA检出在很大程度上依赖检测方法的灵敏度,所以选择合适的分析技术就显得非常重要。就目前而言,在诸多的有关mtDNA的检测方法中,直接测定序列分析是使用最多、最广的方法。测序法要求有测序仪及相应的试剂盒,费用昂贵,操作费时,且对操作人员本身素质要求高,周期长,实际应用常受到限制,在基层难以开展。单链构象多态性(singlestrand conformation polymorphism,SSCP)和限制性片断长度多态性(Rrestrictionfragment length polymorphism,RFLP)技术是经典的突变筛选技术,突出特点是成本低,设备要求简单,周期短,非常适于实验室进行常规技术分型。 鉴于mtDNA特有的环状结构和拷贝数多等特点,对降解和腐败有更强的抵抗力,在骨骼、毛发等特殊生物检材的法医学检验中发挥了重要作用,为了建立一种适合于基层实验室分析的技术,本研究将利用PCR-SSCP和PCR-RFLP方法进行线粒体DNA多态性进行分析,为法医学个人识别、亲权鉴定及群体遗传学提供基础数据。 材料和方法 1、150例辽宁汉族健康无关个体及30例两代家系血液样品200μl、5例死后12h的各主要脏器(心、肝、脾、肺、肾、脑)0.5cm×0.5cm×0.5cm和5例甲醛固定石蜡包埋的组织切片(6μm厚)均由中国医科大学法医学院提供。 2、利用primer5.0设计引物,进行PCR扩增。通过PCR-SSCP和PCR-RFLP方法分析线粒体DNA多态性。利用两种技术分别对150例辽宁汉族健康无关个体进行分析,获得单倍型频率,并进行组织一致性检验以及在亲权鉴定和降解检材的法医学应用。 结果 1、用PCR-SSCP法获得样品清晰的单倍型图谱,150份无关个体血样检出9种单倍型,DP值分别为0.8809。在150例随机个体中,RsaI和MnlI酶切分别发现3和8种表型,DP值分别为0.1073,0.6698。联合两种酶切,发现12种表型,DP值为0.7078。应用两种技术对150例随机个体发现33种组合单倍型,DP值为0.925。 2、在5例正常组织中,各个组织的RFLP带型和SSCP带型完全相同。 3、在30个家系中,母子的RFLP带型和SSCP带型完全相同。 4、5例甲醛固定包埋组织的RFLP分型和SSCP分型与对照组织一致。 结论 1、PCR-RFLP和PCR-SSCP方法用于法医物证的初步筛查简便、快速、经济,适合作为基层实验室线粒体DNA分析的常规方法。 2、mtDNAHVI16106-16297区域在中国辽宁地区汉族具有良好的多态性分布,在法医学上具有较高的应用价值。 3、线粒体DNA多态性较常规STR分析更适合于甲醛固定石蜡包埋组织等非常规法医物证检材的DNA多态性分析。
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:D919

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