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《中国医科大学》 2009年
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马兜铃酸致血管内皮细胞损伤机制探讨及羟苯磺酸钙的拮抗作用

邓婧宜  
【摘要】: 目的 马兜铃酸肾病(AAN)是一种快速进展的肾小管间质疾病,对其发病机制的认识尚未完全达成共识。近年来有关马兜铃酸(AA)致肾小管周毛细血管网丢失造成小管间质缺血缺氧、小管萎缩,间质纤维化的研究有增加趋势。内皮细胞裱褙血管内壁,是血管损伤的关键靶组织,直接接受血液中有害物质毒害,承受各种应激,内皮细胞具有多种细胞因子分泌功能,信息传递、抗凝等复杂的舒缩调节功能,直接参与血管的形成和重塑。所以AA对血管内皮细胞(VEC)的损伤及拮抗途径的研究,将为慢性马兜铃酸肾病(CAAN)的治疗,寻找一条新的途径。 本实验通过体外培养人脐静脉内皮细胞系(HUVEC),FLuo-3钙离子探针检测HUVEC胞内钙离子浓度([Ca~(2+)]i)变化,ELISA法测定细胞培养上清液中血栓调节蛋白(TM),倒置显微镜及透射电镜观察细胞形态及超微结构改变。探讨AA对VEC([Ca~(2+)]i)的影响,并观察不同浓度的羟苯磺酸钙在不同培养时间点对VEC钙离子稳态的影响,对VEC的保护作用。 材料与方法 一、实验材料 主要试剂:人脐静脉内皮细胞系(HUVEC)、DMEM低糖培养基、优等胎牛血清、胰蛋白酶、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、二甲基亚砜(DMSO)、马兜铃酸钠盐(工作浓度10mg/l)、羟苯磺酸钙原粉、FLuo-3,AM 5μM、血栓调节蛋白(TM)ELISA预包被试剂盒。主要仪器:温浴箱、Olympus光学显微镜、高压锅、冰箱、显微镜带自动显微照相装置、细胞内钙离子荧光成像测定系统。 二、实验方法 1、细胞培养 HUVEC用含10%胎牛血清,10μg/ml的链霉素,10U/ml的青霉素的低糖DMEM培养基中培养,37℃,5%CO_2恒温培养箱孵育。 2、实验分组及处理 培养HUVEC随机分为三组:①正常对照组(对照组);②AA-Na组(AA组);③羟苯磺酸钙组(干预组)。将AA-Na粉加入DMEM培养基中,配置成10mg/l的溶液。将羟苯磺酸钙原粉加入DMEM培养基中,配置成浓度为10μM、25μM、50μM的溶液。对照组用完全DMEM培养基培养,AA组和干预组均用含AA-Na的DMEM培养基培养24h后,干预组再随机分三组,分别加入含上述浓度羟苯磺酸钙的DMEM培养基中再培养24h、48h。 3、各组细胞([Ca~(2+)]i)测定 将各组细胞分别接种于塑料培养皿中。按上述处理后,弃原培养液,每皿用无钙磷酸盐缓冲液(PBS液)(pH7.2)洗2次,定容至1ml,加入已配制好的FLuo-3,AM工作液(5μM)50μl,37℃,5%CO_2孵箱中孵育40min,无钙PBS液洗2次后按组进行试验。将负载FLuo-3,AM的各组细胞置于细胞内钙离子荧光成像测定系统操作台上,37℃测定单个细胞钙荧光强度。 4、各组细胞培养上清液中TM含量测定 收集各组细胞培养上清液各100μl,按照TM检测试剂盒所示ELISA方法及程序检测,每组重复6次,检测各组TM含量。 5、各组细胞形态观察 各组细胞置倒置显微镜及投射电镜下,观察总体形态、单层细胞变化及细胞超微结构变化情况。 三、统计学处理 所有计量资料以((?)±S)表示,采用SPSS16.0统计软件进行分析,多组间样本均数比较用方差分析。P<0.05为有统计学意义。 结果 一、各组细胞([Ca~(2+)]i)变化 应用AA-Na后,HUVEC([Ca~(2+)]i)迅速升高,5分钟内达高峰,70分钟后降至平稳水平。AA组平均([Ca~(2+)]i)明显高于对照组,P<0.05。干预组平均([Ca~(2+)]i)与AA组相比,均有一定程度的下降。羟苯磺酸钙对([Ca~(2+)]i)的作用,其下降趋势呈浓度依赖性,培养48h后,与培养24h的值相比,虽略有下降,但两者比较无显著性差异。 二、各组细胞培养上清液TM检测结果 应用AA-Na后,TM明显增多,与对照组相比,P<0.05。而应用了不同浓度的羟苯磺酸钙钙处理后,各组的TM含量均有一定的下降,羟苯磺酸钙浓度为25μM、50μM时,细胞培养24h或48h,与对照组相比,p>0.05,与AA组相比,P<0.05。 三、各组细胞形态观察结果 (一)倒置相差显微镜观察结果 对照组:细胞贴壁单层生长,呈铺路石样排列,细胞轮廓清晰,胞核为圆形或椭圆形,细胞生长旺盛,几乎无脱落;AA组:细胞贴壁能力减弱,部分在培养液中悬浮,贴壁细胞体积缩小、变圆;不同浓度羟苯磺酸钙下细胞贴壁生长良好,少有脱落。 (二)透射电镜细胞超微结构观察结果 1、电镜下各组细胞核变化情况 对照组正常细胞形态,核完整;AA组细胞核形不规则、凹陷;干预组:细胞的核形均比较规则。 2、各组细胞胞质中内质网线粒体改变情况 对照组内质网、线粒体正常;AA组粗面内质网扩张呈池状,线粒体少数有嵴缺损,空泡变性;干预组线粒体出现嵴缺损变少,粗面内质网比较完整。 结论 AA能使VEC钙超载,致内皮破坏,TM增加,内质网和线粒体破坏;羟苯磺酸钙可以通过保护线粒体、内质网,减少VEC钙超载,保护VEC。
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R692.9

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