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5-脂氧化酶与百草枯中毒肺损伤的相关性研究

马壮  
【摘要】: 目的 百草枯(paraquat,PQ)1962作为除草剂上市后,在130多个国家广泛使用,1966年首次报道百草枯中毒致死病例。PQ中毒可引起多脏器损害,肺是其作用的主要靶器官,表现为急性肺泡炎和迅速进展的肺间质纤维化,是PQ中毒死亡的主要原因。因此百草枯中毒的治疗主要集中在减轻肺损伤。百草枯的中毒机制尚未完全阐明,大量研究证实,以多形核中性粒细胞(polymorphonuclear neutrophils,PMN)为主的炎性细胞与多种细胞因子在其发病过程中起着重要作用,其中炎性细胞因子网络失控已逐渐成为国内外研究者关注的焦点,而如何调控炎性细胞因子的过度释放,使细胞因子网络恢复平衡状态也已成为研究热点。白三烯(leukotrienes,LTs)是重要的炎症介质。肺脏是花生四烯酸的主要合成场所,LTs是经由5-脂氧化酶(5-lipoxygenase,5-LO)途径的主要花生四烯酸产物,它由肺泡巨噬细胞和中性粒细胞合成释放。LTs通过刺激骨髓多功能造血干细胞以及这些细胞在血液中的游走而影响白细胞。白三烯还能增加粘附分子的表达(故而增强白细胞对微血管的粘附能力),促进细胞运动,使其向靶器官组织游移。一旦白细胞到达炎症组织局部,白三烯可增强其生存力和活性。白三烯主要介导中性粒细胞、单核巨噬细胞、肥大细胞的募集。白三烯在肺脏炎症反应中对白细胞的趋化作用,可能激发肺脏炎症反应的瀑布效应。在Baud等的研究中5-LO的下游产物LT对纤维细胞的迁移,增殖以及基质蛋白的增生有直接的作用。外源性给予LTD4可以引起鼠类及人类的纤维细胞增殖并且这种增殖呈剂量依赖性。研究表明,LTs作为一种重要的前炎症介质,在许多炎性疾病发病机制中的重要作用已被逐渐认识,但其在PQ中毒发病过程中的作用尚不清楚。本研究的目的旨在从炎性细胞的角度探讨5-脂氧化酶与PQ中毒肺损伤的相关性。 材料与方法 1、动物分组 健康雌性Wistar大白鼠40只,完全随机分成对照组和染毒组,染毒组以百草枯50mg/kg体重灌胃染毒,对照组给以等量的生理盐水。分别于1d,3d,7d,14d处死10只,进行支气管肺泡灌洗液的收集及细胞测定,应用RT-PCR反应、免疫组织化学方法,观察5-LO在mRNA和蛋白水平的变化。 2、支气管肺泡灌洗液的测定 采用在体全肺灌洗法收集支气管肺泡灌洗液,共收集到支气管肺泡灌洗液约5ml。1500rpm,4℃,离心10min,将离心沉淀的细胞团用0.3ml生理盐水悬浮,制成细胞悬液。用全自动血细胞计数仪(AC900型)测定支气管肺泡灌洗液白细胞总数。 3、RNA提取及RT-PCR 用TRIZOL提取总RNA,反转录成cDNA。5-LO基因上游引物5'-CTCCCAGTGACCACAGAA-3',下游引物5'-ATACCGAACACCTCAGACA-3',扩增片段长496bp,β-actin作为内对照(扩增片段247bp)。循环条件:95℃,变性5min,94℃30s-54℃1min-72℃30s,35个循环,72℃延伸5min。15%琼脂糖凝胶电泳检测。 4、免疫组织化学 肺组织石蜡切片免疫组织化学方法检测5-LO蛋白表达,用链霉菌抗生物素蛋白—过氧化酶染色法,按试剂盒说明书操作。 结果 1、病理变化 HE染色切片观察,染毒后1d肺泡结构清晰可见,肺泡腔内可见少量炎性细胞的渗出;染毒后3d肺泡结构可辨认,肺泡腔内可见大量炎性细胞的渗出;染毒后7d肺泡结构尚可辨认,肺泡腔内充满炎性细胞的渗出,同时肺泡腔内渗出液开始机化;染毒后14d肺泡结构不清晰,肺泡腔内充满炎性细胞的渗出,但较前有所减少,可见纤维化样改变。 2、BALF中WBC总数的变化 染毒组大鼠BALF中WBC总数比对照组均有统计学意义(P<0.01)。WBC水平从1d开始增高,7d达高峰,14d较7d有所减少。 3、5-LO的变化 染毒组大鼠5-LO表达比对照组均有统计学意义(P<0.01)。5-LO水平从1d开始增强,7d为表达达高峰,14d较7d有所减少。且蛋白和基因水平变化趋势基本相一致。 结论 研究表明大鼠BALF中WBC总数与病理学变化趋势基本上是一致的。5-LO蛋白和基因水平的变化趋势基本上是一致的。大鼠BALF中WBC总数与5-LO免疫组化结果IOD值之间存在显著的正相关关系(r=0.981,P<0.001)。通过本试验研究,提示5-LO可能通过影响肺组织中WBC含量的变化在百草枯引起的急性肺损伤及肺纤维化中有一定作用。


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