收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

无机砷对核转录因子Nrf2和血红素单加氧酶HO-1的诱导作用

张新玉  
【摘要】: 目的 砷是地壳中一种常见类金属元素,广泛分布于环境中。人类在生产生活中通过食物、饮水、呼吸等途径接触到砷化物,流行病学调查和实验室研究显示急性或慢性砷暴露都会对机体产生损伤。到目前为止,全球已有接近2亿人处在饮用高砷水的危害中。慢性饮水型砷暴露可以导致皮肤角化、色素脱失和沉着、神经系统损伤、心血管疾病和各器官肿瘤。目前,砷中毒发病机制尚不清楚,但近年来,在众多机制研究中,砷诱发活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)产生并导致氧化损伤的学说受到越来越多的关注。有人群资料证实慢性砷暴露可引起体内氧化应激反应,ROS生成增多;并且低浓度的ROS作为细胞内反应的信号中间传递体,通过介导体内的某些氧化应激敏感性的信号转导途径而发挥重要作用。目前,核转录因子(transcription factor NF-E2-related factor 2,Nrf2)在调控氧化应激中所起的作用受到越来越多的关注。核转录因子Nrf2,是锌指蛋白(bZIP)Cap‘n'Collar家族中的一员,在激活很多编码抗氧化酶和Ⅱ相药物代谢酶表达的过程中起着重要的调控作用,其调控作用通过抗氧化反应元件(antioxidantresponse elements,AREs)实现。 在众多的被Nrf2激活的抗氧化物酶中,血红素单加氧酶(heme oxygenase 1,HO-1)的诱导表达受到广泛的关注,其在增强机体的抗氧化能力方面起着重要的作用。HO-1是HO热休克蛋白中的一种,在正常组织中表达甚微,只有在氧化应激情况下才大量产生,增加机体抵抗力,维持机体生存。 综上所述,本研究以NaAsO_2为暴露因素,以正常人肝细胞株Chang liver为靶细胞,观察无机砷对Chang liver细胞活力、细胞中ROS、细胞内谷胱甘肽(glutathione,GSH)等氧化应激指标的影响作用及细胞中核转录因子Nrf2及其调控的下游靶基因HO-1蛋白表达的影响作用;以及加入GSH合成的抑制剂丁硫氨酸亚矾胺(_L-buthionine-[S'R]-sulfoximine,BSO)后对上述指标表达的影响作用,从而为砷中毒的发病机制研究提供一定的依据。 方法 一、实验方法 (一)细胞培养 Chang liver细胞系购自中科院上海细胞库(ZN1003)。细胞常规培养于RPMI1640培养基(含10%胎牛血清,1×10~5U/L青、链霉素),5%CO_2、37℃条件下培养。待细胞达到80%-90%融合时,以1:3进行传代。 (二)细胞增殖活力检测 采用Alamarblue法。实验分组为:单纯染砷组、BSO预处理组。用酶标仪测定各孔的吸光度值,计算Alamarblue的还原百分率,还原率越高,表示细胞增殖活力越强。 (三)BSO预处理后细胞内GSH含量的测定 GSH试剂盒(DTNB)法测定细胞内GSH含量,考马斯亮蓝法测定细胞内蛋白以校正GSH含量。实验分组为单纯染砷组和BSO预处理组。 (四)细胞内ROS测定 采用2',7'-二乙酰二氯荧光素(DCFH-DA)法测定细胞内ROS含量。实验分组为单纯染砷组和BSO预处理组。 (五)免疫印记(western blotting)实验 1、蛋白提取(Nrf2和HO-1蛋白) 实验分组为:单纯染砷组,BSO预处理组。细胞裂解后提取蛋白,考马斯亮蓝法对蛋白定量。 2、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 3、转膜 采用半干转方法将蛋白转印至PVDF膜上(216 mA,1 h)。 4、杂交 杂交抗体浓度为:一抗浓度:Nrf2(1:1000)、HO-1(1:1000)和内参β-actin(1:5000);二抗浓度都为:1:5000。 5、化学发光反应 按照ECL试剂盒操作步骤,用凝胶成像分析仪曝光显像,凝胶成像分析系统进行蛋白灰度值分析,结果用实验组的平均灰度值与对照组的平均灰度值的相对值表示。 二、统计学处理 采用SPSS 11.5统计软件进行分析,组与组之间用两组独立样本t-test;组间比较采用单因素方差分析(ANOVA),两两比较采用LSD-t检验。 结果 (一)细胞形态改变 染砷24 h条件下,对照组细胞生长状态良好,细胞呈典型的上皮细胞形态,为扁平的三角或多角形,胞质近中央处有一个或两个圆形的细胞核,细胞形态一致,界限清晰;10μmol/L组部分细胞收缩变形、体积变小,失去正常细胞间的紧密连接,少量细胞脱离培养基质而悬浮;50μmol/L组细胞收缩变圆、变形、变小、细胞数量减少,间隙增大,多数细胞脱离培养基质、悬浮于培养液;100μmol/L组细胞脱壁现象更加严重,细胞多数变圆,与对照组相比,仅可见小部分细胞贴壁。 (二)细胞增殖活力的改变 1、NaAsO_2单独作用:各浓度的NaAsO_2溶液作用于细胞24 h后,Alamarblue还原率降低,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01),且随着染砷剂量的增加,还原率也逐渐降低,100μmol/L组,还原率最低,为对照组的0.35±0.06倍。 2、BSO预处理对Chang liver细胞活力的影响:3 mmol/L BSO预处理12 h后,染砷24 h,细胞还原率与同组单独染砷相比还原率均明显降低(P<0.01)。 (三)BSO预处理对Chang liver细胞中GSH含量的影响 1、2.5和5μmol/LNaAsO_2溶液单独作用24 h,细胞内GSH含量逐渐增高,NaAsO_2溶液10μmol/L组GSH含量低于对照组,分别与对照组相比差异有统计学意义(p<0.01);BSO预处理12 h再加入NaAsO_2溶液处理24 h后,细胞内GSH与同组的单独染砷组相比明显降低且差异有统计学意义(p<0.01)。 (四)BSO预处理对Chang livet细胞内ROS的影响 BSO预处理12 h,加入各浓度的NaAsO_2溶液处理24 h,细胞内ROS含量明显升高。与同组单独NaAsO_2溶液处理组相比明显升高,差异有统计学意义(p<0.01)。 (五)NaAsO_2对细胞中核转录因子Nrf2蛋白表达的活化作用 细胞染毒0-24 h后,NaAsO_2能够持续诱导细胞内核转录因子Nrf2蛋白表达增加,5μmol/L NaAsO_2溶液染毒12 h,10μmol/L NaAsO_2溶液染毒2、6、12 h的核转录因子Nrf2蛋白表达均强于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。且核转录因子Nrf2蛋白表达的活化具有时间相关性,即在NaAsO_2溶液染毒12 h时核转录因子Nrf2蛋白表达的活化出现高峰,而后仍然维持在高于对照组的水平。 (六)NaAsO_2对细胞中HO-1蛋白表达的活化作用 NaAsO_2染毒浓度为10μmol/L,染毒时间为6 h、12 h和24 h组,细胞内HO-1蛋白含量逐渐增加,与对照组(0 h)相比差异有统计学意义(p<0.05或p<0.01);5和10μmol/L组,6 h、12 h和24 h各组之间,随着染毒时间的增加,细胞内HO-1蛋白表达逐渐增加,差异有统计学意义(p<0.01)。 结论 (一)砷能够使细胞内产生氧化应激,进而使细胞内Nrf2蛋白表达增强,从而引起其下游靶基因HO-1蛋白的表达增加,使细胞抗氧化能力增强。 (二)GSH合成的抑制剂BSO能够使Chang liver细胞内氧化应激水平增加,核转录因子Nrf2和HO-1蛋白表达增强,说明了细胞内巯基水平能够拮抗砷引起的细胞毒性作用。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 徐岩;曹学兵;;谷胱甘肽与帕金森病[J];国外医学.老年医学分册;2000年06期
2 孙鲜策;刘珊;孙贵范;高颖;;细胞内谷胱甘肽对砷细胞毒性的保护作用[J];环境与健康杂志;2006年01期
3 王毅,陆春伟,高颖,王路,吕秀强,孙贵范;香烟烟气溶液和砷联合作用对淋巴细胞的影响[J];中国公共卫生;2005年08期
4 李冰;刘洁;李昕;张新玉;朱博;刘丹;邢晓越;孙贵范;;亚砷酸钠对核转录因子Nrf2和血红素单加氧酶-1表达的影响[J];环境与健康杂志;2009年12期
5 程继忠,邬惠琼,宋瑞琨,皇甫永穆,柴莲花,王心刚;亚砷酸钠对大鼠肝线粒体和微粒体酶的影响[J];卫生研究;1996年05期
6 孙鲜策,孙贵范,刘珊,张颖,金亚平,王路,林刚,胡云秋;亚砷酸钠对HaCaT细胞的氧化应激作用[J];卫生研究;2005年01期
7 程继忠,邬惠琼,宋瑞琨,王心刚,柴莲花;硒多糖、亚硒酸钠对大鼠肝线粒体酶的影响及其拮抗亚砷酸钠毒性作用的机理[J];同济医科大学学报;1996年02期
8 程继忠,邬惠琼,海涛,宋瑞琨;硒多糖、亚砷酸钠对大鼠肝微粒体酶和GSH-Px等的影响[J];卫生毒理学杂志;1999年01期
9 尹菊,刘立峰,周仲华;谷胱甘肽、SOD软膏红外线照射治疗外阴营养不良的疗效分析[J];中国医科大学学报;1998年06期
10 肖南,刘韧,田昆仑,刁有芳,汪志文;还原型谷胱甘肽对亚砷酸钠诱导的内皮细胞凋亡的保护作用[J];细胞生物学杂志;2000年04期
11 胡欣;张弘;;还原型谷胱甘肽对糖尿病脂代谢的影响[J];临床荟萃;2008年12期
12 李富君,孙贵范;砷对小鼠心脏某些生化功能的影响[J];卫生毒理学杂志;1998年03期
13 林健;文富强;;Nrf2-Keap1抗氧化系统与慢性阻塞性肺疾病[J];西部医学;2009年09期
14 于媛;刘文虎;;抗坏血酸对静脉铁剂诱导氧化应激的影响[J];中国全科医学;2006年06期
15 江涛;赵亮;郑洁静;王璐璐;续洁琨;姚新生;栗原博;;束缚应激反应对小鼠晶状体抗氧化能力指数的影响[J];中国药理学通报;2006年07期
16 杨吉锋;陶松桔;张亚萍;惠辉;伍蔚凌;;初诊2型糖尿病患者氧化应激状况及与糖尿病发病的相关性[J];医学信息(上旬刊);2011年06期
17 张春平;HIV-1阳性的G6PD缺乏病人的存活率不受病毒所致氧化应激反应的影响[J];国外医学.内科学分册;1998年11期
18 谷兆侠;张俊河;张煜;周延升;;同型半胱氨酸促氧化作用机制探讨[J];医药论坛杂志;2008年05期
19 张新玉;李冰;李昕;朱博;孙贵范;;无机砷对Chang肝细胞活性氧的诱导和核转录因子表达的影响[J];环境与健康杂志;2008年11期
20 肖白,崔明珍,杨华;亚砷酸钠诱发人外周血淋巴细胞染色体断裂位点研究[J];卫生毒理学杂志;1989年04期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 李丽;蔡玲;李卉卉;杨小弟;;溶液中纳米形态铝化合物对辅酶和谷胱甘肽分子构象的影响[A];第六届全国化学生物学学术会议论文摘要集[C];2009年
2 鄢祝兵;段友容;马勇杰;古宏晨;徐宏;;谷胱甘肽修饰的纳米Fe_3O_4与人肺腺癌细胞SPC-A1相互作用的初步研究[A];第四届中国肿瘤学术大会暨第五届海峡两岸肿瘤学术会议论文集[C];2006年
3 王幽香;张然;徐志学;胡巧玲;;生物响应非病毒基因载体的构建[A];2009年全国高分子学术论文报告会论文摘要集(下册)[C];2009年
4 王鹏;海春旭;秦绪军;李文丽;梁欣;张晓迪;陈宏莉;刘瑞;;GSH在动物光气染毒中作用的研究[A];中国毒理学会第四届全国学术会议论文(摘要)集[C];2005年
5 张元;刘晶;赫春香;;荧光动力学分析法测定谷胱甘肽的抗氧活性[A];中国化学会第十三届有机分析与生物分析学术会议论文集[C];2005年
6 李永文;夏和生;;双重响应聚合物胶束制备及高强度聚焦超声控制释放行为[A];2009年全国高分子学术论文报告会论文摘要集(下册)[C];2009年
7 陆海涛;邓颖;张德全;;注射用还原型谷胱甘肽对急性心肌梗死缺血/再灌注心肌的保护作用[A];2004年全国危重病急救医学学术会议论文集[C];2004年
8 丁轲;谭天伟;;硫脲树脂分离提纯谷胱甘肽[A];第一届全国化学工程与生物化工年会论文摘要集(下)[C];2004年
9 朱林佩;王英;张亚非;;谷光甘肽对金纳米粒子的粒径控制[A];中国微米、纳米技术第七届学术会年会论文集(一)[C];2005年
10 张明永;王颖;麦维军;曾纪晴;蔡昭艳;;水稻谷胱甘肽的合成、运输与功能分析[A];2006中国植物细胞发育与分子生物学学术研讨会论文集[C];2006年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 孙鲜策;亚砷酸钠对人皮肤角质形成细胞氧化应激、细胞周期及细胞凋亡作用的研究[D];中国医科大学;2005年
2 吴丽华;亚砷酸钠诱导细胞死亡的分子机制研究[D];山西大学;2011年
3 史艳芬;亚砷酸钠对人脐静脉内皮细胞的促凋亡作用及分子机制研究[D];吉林大学;2011年
4 赵锐;转录因子NF-E2相关因子在砷诱导的人类HaCaT细胞抗氧化反应和细胞毒性中作用的研究[D];中国医科大学;2010年
5 龚频;内吗啡肽体内抗氧化活性及其体外氧化代谢产物的研究[D];兰州大学;2009年
6 李新娜;亚砷酸钠及保护剂对血管内皮细胞效应中microRNAs的作用研究[D];吉林大学;2013年
7 董雪;亚砷酸钠血管效应及诱导EMT作用研究[D];吉林大学;2011年
8 钟卫一;硫氧还蛋白-1在实验性急性坏死性胰腺炎大鼠的表达及褪黑素干预的影响[D];广西医科大学;2009年
9 富景奇;亚砷酸钠对胰岛β细胞功能的影响及其机制研究[D];中国医科大学;2010年
10 王秋林;机体氧化还原状态的研究[D];四川大学;2005年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 张新玉;无机砷对核转录因子Nrf2和血红素单加氧酶HO-1的诱导作用[D];中国医科大学;2009年
2 蔡德雷;用多项生物标志物评价家用洗涤剂对小鼠肝脏解毒系统和抗氧化系统的早期影响[D];浙江大学;2003年
3 倪海峰;体外循环致中性粒细胞NF-κB激活、ICAM-1表达及谷胱甘肽干预作用的研究[D];第三军医大学;2003年
4 刘雁程;谷胱甘肽基因的克隆表达及其抗紫外辐射功能的研究[D];武汉大学;2005年
5 戚元成;导入盐地碱蓬谷胱甘肽转移酶基因对拟南芥耐盐性的影响[D];山东师范大学;2002年
6 闫宁;谷胱甘肽氧化还原状态改变对半乳糖胺/脂多糖介导急性肝损伤发生影响[D];山西医科大学;2003年
7 张琴;利用啤酒废酵母生物合成谷胱甘肽及其分离过程的研究[D];浙江大学;2002年
8 荣延平;复方六月雪对急慢性化学性肝损伤保护作用及其机制的研究[D];广西医科大学;2002年
9 井万里;还原型谷胱甘肽对大鼠随意皮瓣成活影响的实验研究[D];四川大学;2005年
10 段新瑞;半胱氨酸和谷胱甘肽的纳米粒子共振光散射探针研究[D];河北大学;2006年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 永霖;药物性肝病“克星”———谷胱甘肽[N];大众卫生报;2005年
2 蔡德山;谷胱甘肽市场前景光明[N];中国医药报;2011年
3 特约撰稿 蔡德山;国产谷胱甘肽的美好时光[N];医药经济报;2011年
4 通讯员刘骁;谷胱甘肽可增强人体免疫力[N];科技日报;2003年
5 青松;国嘉茴三硫治疗酒精肝有效[N];中国医药报;2007年
6 徐述湘;氧化应激 治疗COPD新靶点[N];中国医药报;2003年
7 顾雪冬;大脑喜欢“吃”什么[N];中国医药报;2002年
8 景文;国产还原型谷胱甘肽滴眼液“天亿”登场[N];医药经济报;2005年
9 张年华;三方面探寻对乙酰氨基酚肝毒性机制[N];中国医药报;2007年
10 瓮晓梅;玉米是金[N];大众科技报;2001年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978