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《中国医科大学》 2010年
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胚胎干细胞中外源性IbeB靶蛋白的筛选及验证

姜静宜  
【摘要】: 目的 人们在研究致病菌与宿主细胞相互作用过程中,于致病菌中发现了一些效应蛋白(protein effectors),它们被细菌分泌出来后,有些可被输送到宿主细胞的细胞质和细胞核中,这些蛋白不仅参与细菌侵袭宿主细胞过程,而且影响宿主细胞的某些重要功能。例如,单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)外膜蛋白InlB,通过肝细胞生长因子受体(Hepatocyte growth factor receptor, HGF-R orMet)影响肝再生;李斯特菌溶血素能够使上皮细胞内的组蛋白H3S10去磷酸化;志贺氏菌通过细菌Ⅲ型分泌直接将其效应蛋白OspF注射到上皮细胞的细胞核,通过阻止组蛋白H3的磷酸化而使NF-κB启动子部位的染色质重塑。这些出乎意料的结果为认识真核细胞生物学特性提供了新线索,从某种意义上说致病菌蛋白可作为研究真核细胞生物学功能的有力工具。ibeB基因是大肠杆菌K1株侵袭人脑微血管内皮细胞相关基因,其成熟蛋白剪切方式类似革兰氏阴性细菌Ⅳ型分泌蛋白。本实验室将ibeB基因转染真核细胞,希望探索其对真核细胞生命活动的影响,结果发现:(1)转染ibeB基因的HeLa细胞呈现胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性的神经样改变;(2)经ibeB基因稳定转染的小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES cell)AB2.1具有向神经前体细胞分化的潜能。 本课题旨在筛选胚胎干细胞中外源性IbeB的靶蛋白,希望阐明IbeB调控胚胎干细胞向神经前体细胞分化机制,为研究神经分化的调控机制积累资料。 方法 1、酵母双杂交法筛选IbeB相互作用蛋白。 2、在酵母菌中验证IbeB与Cathepsin A相互作用。 3、在大肠杆菌BL21中诱导GST-IbeB融合蛋白表达并利用亲和层析纯化。 4、利用GST-pull down实验体外验证IbeB与Cathepsin A相互作用。 5、Western blot和免疫组织化学方法检测(Cathepsin A在小鼠脑发育过程中的表达。 结果 1、酵母双杂交方法筛选出胚胎干细胞中外源性蛋白IbeB的相互作用蛋白Cathepsin A。 2、小量酵母双杂交方法验证IbeB与Cathepsin A相互作用。 3、GST-pull down方法证实IbeB与Cathepsin A相互作用。 4、Cathepsin A在小鼠脑内的表达随发育的进程呈逐渐升高再逐渐降低的规律性变化,其中在胚胎14.5天表达最高。Cathepsin A在小鼠胚胎脑组织细胞核也有少量表达。 结论 Cathepsin A是胚胎干细胞中外源性蛋白IbeB的相互作用蛋白。Cathepsin A在小鼠脑发育过程中的表达呈先逐渐升高再逐渐降低的规律性变化,部分在细胞核表达。
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R329.2

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